Detlef Weigel教授开发CRISPR-finder,实现高通量、低成本地植物基因组编辑突变体筛选

植物基因技术 基因组编辑技术
eplants    2021-01-20    541

  2021年1月16日,Quantitative Plant Biology 在线发表了德国马普发育生物学研究所Detlef Weigel教授为通讯作者题为“CRISPR-finder: A high throughput and cost-effective method to identify successfully edited Arabidopsis thaliana individuals” 的研究论文。开发了CRISPR-finder方法,可实现高通量、低成本筛选CRISPR/Cas9基因组编辑突变个体。

图片.png

  利用CRISPR/Cas系统进行基因组编辑,可以使用Cas内切酶和人工引导RNA对基因组的靶区域进行突变。由于这些突变产生的效率不同,而且修复过程产生了一系列突变,因此需要确定已发生突变的个体在目标基因座处的基因组序列,识别所需的突变通常需要大量的筛选工作。筛选诱导突变通常有两种常见方法:一是单个PCR产物的Sanger测序;二是T7核酸内切酶1(T7E1)分析。但是,这两种方法都不能立即精确识别所需区域的突变。

  该研究提供了一个完整的扩增子产生及在目标区域中鉴定精确突变的实验方法——CRISPR-finder。作者首先制备了扩增子文库,该文库通过两步PCR扩增产生的,第一步使用特定的寡核苷酸组合,在PCR过程中,添加了移码核苷酸和96个条形码。接着基于移码核苷酸和条形码的独特组合,能够在一次Illumina MiSeq运行中对数百个样本进行测序,例如超过900个样本。该方法可在一次测序运行中处理成千上万个样本。为了说明该方法的准确性和精密度,作者详细介绍了如何鉴定和鉴定了一个ISOCHORISMATE SYNTHASE 1(ICS1)基因的突变系,与野生型相比,其水杨酸合成出现缺陷。

图片.png

  扩增子制备。(A)目标基因--ICS1的示意图。黑框表示外显子,灰色框表示未翻译区域。箭头显示了转录的方向。基因开头和结尾的数字与基因组坐标相对应。(B)-(D)扩增子制备。(B)扩增基因组特定区域的第一个PCR步骤。这一步中的寡核苷酸引物融合了TruSeq接头的第一部分(灰色)和移码核苷酸(红色)。(C)第二次PCR扩增添加了TruSeq适配器的最后部分(紫色)和96个条形码中的一个(橙色)。(D)带有移帧碱基对(红色)、TruSeq接头(灰色和紫色)和条形码(橙色)的最终扩增子。

图片.png

本文为专栏作者授权科易网发表,版权归原作者所有。文章系作者个人观点,不代表科易网立场,转载请联系原作者。如有任何疑问,请联系ky@1633.com。
热门观点