AC:嵌合DNA探针辅助连接酶链式反应与电化学传感策略联用对RNA单碱基突变的超灵敏检测

电化学技术 检测技术
秦川    2021-01-18    216

  背景介绍

  RNA单碱基突变在人类疾病中扮演了重要的作用。因此,准确并敏感地检测RNA单碱基突变对一些疾病的诊断具有重要作用。然而,在临床样本中,由于痕量的RNA单碱基突变通常存在于大量野生型的RNA中,目前临床常用的RNA的检测方法如qRT-PCR等在临床样本的检测中遇到了挑战。近期,福建医科大学林新华教授课题组与福建医科大学附属第一医院陈锦元博士等合作,报道了一种高敏感性及特异性RNA单碱基突变检测方法,相关成果以“Ultrasensitive Detection of RNA with Single-Base Resolution by Coupling Electrochemical Sensing Strategy with Chimeric DNA Probe-Aided Ligase Chain Reaction”为题发表在国际化学权威杂志Analytical Chemistry上。

  研究主要内容介绍

图片.png

  基于嵌合DNA探针辅助连接酶链式反应电化学传感技术检测RNA单碱基突变的示意图

  (来源:Analytical Chemistry)

  为了以RNA为模板连接两条互补的短链DNA探针,作者在其中一条短链DNA探针的3’端修饰两个核糖核苷酸,形成嵌合DNA探针(S-cmDNA)。在T4 RNA连接酶2的作用下,以目标RNA为模板可将互补的cmDNA探针及正常的DNA探针连接,形成长的cmDNA探针(L-cmDNA)。接着以此L-cmDNA探针为模板,在DNA连接酶的作用下,进行连接酶链式反应(ligase chain reaction, LCR),产生大量的两端分别带巯基及生物素的双链DNA产物。最后,产生的双链DNA产物通过Au-S键固定于BSA修饰的金电极表面,当滴加SA-PolyHRPs后,HRP上的亲和素与DNA双链产物的生物素相结合,从而使HRP固定于金电极表面,并催化TMB底液产生电化学电流信号,进而对目标RNA进行定量检测。

图片.png

  图1A利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Denaturing PAGE)对以RNA为模板进行连接反应后的产物进行表征,表明在T4 RNA连接酶2的存在下,以RNA为模板,cmDNA能够产生RNA模板依赖的高效、位点特异连接,证明了该方法的可行性。图1B为利用琼脂糖凝胶电泳对以完全互补cDNA及单碱基错配DNA为模板进行LCR的产物进行表征,表明在高浓度条件下,传统LCR方法并不能很好地识别单碱基错配DNA。

图片.png

  图2A,B分别为构建的cmDNA-eLCR方法检测含有100 fM RNA和空白样本的循环伏安曲线及安培电流曲线,从图中可以看出,构建cmDNA-eLCR方法可有效的区分溶液中的目标RNA。图2C为基于LCR的三种不同方法检测含100 fM目标RNA样本及空白样本的电流强度图。从图中可以看出,只有当嵌合DNA存在时,T4RNA连接酶2才能显示出很高的连接效率,从而可以明显地区分空白样本。

图片.png

图片.png

  图3A,B为在最佳的实验条件下,构建的cmDNA-eLCR检测方法检测不同浓度RNA的电流曲线。结果显示1.0×10?15 M至1.0×10?10M浓度之间,电流强度和目标RNA浓度的对数呈现良好的线性关系,检测限为0.6 fM,表明该方法具有优异的灵敏度。

图片.png

  图4 显示构建的cmDNA-eLCR在检测目标高浓度的条件下(100 pM),仍可有效地区分完全互补的目标RNA及单碱基错配的RNA(图A)。作为比较,在相同实验条件下,利用传统的eLCR在高浓度下并不能区分完全互补的cDNA及单碱基错配的DNA(图B)。显示了构建的cmDNA-eLCR具有很强的抗干扰能力,在检测复杂临床样本中已知突变RNA具有巨大潜能。

  小结

  本文中,作者设计了一种3’端修饰两个核糖核苷酸的短链嵌合DNA探针,在T4 RNA连接酶2的催化下,可以RNA为模板,与另一正常短链DNA特异、高效地连接形成长链嵌合DNA探针,并触发LCR反应。接着利用电化学传感策略对LCR产物进行检测,从而达到对目标RNA的特异性检测。该方法避免了RNA的逆转录步骤,也无需额外的分离。实验结果表明该方法具有很高的敏感性,即使在检测目标高浓度的条件下,该方法仍具有很高的特异性,可鉴别出溶液中的单碱基突变,这为其检测存在大量野生系列的复杂临床样本提供重要保证。此外,在1 ul NB4细胞RNA提取液与低浓度目标RNA共同存在情况下,该方法显示出很强的抗干扰能力,可准确的检测出溶液中痕量目标RNA,显示出该方法在已知突变的RNA为标志的相关疾病诊断中具有广阔的应用前景。


本文为专栏作者授权科易网发表,版权归原作者所有。文章系作者个人观点,不代表科易网立场,转载请联系原作者。如有任何疑问,请联系ky@1633.com。
热门观点