【分析】ACS Nano:全介电超表面荧光生物传感器用于高灵敏检测抗体/抗原 原创 你喜欢的样子 CBG资讯

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CBG资讯    2021-01-07    794

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  随着固定的靶分子数量的增加,全介电超表面上共振位移变大,这种效应产生的的原理与表面等离子体共振方法中的原理相同。为了达到即时医学检测的目标,可将全介电和等离子超表面与微流控芯片相结合,实现在人血清中癌症标志物的灵敏检测检测。与没有金属沉积的等离子超表面相比,全电介质超表面制造相对简单,在实际应用中实现较低的成本。全电介质超表面的另一个优点是通过清洗超表面基质,可重复使用,这一优势将有助于大幅降低运营成本。目前,没有研究表明所有介电超表面都可以促进高度敏感的荧光传感。因此,开发一种全介电的高效荧光传感平台实现低浓度目标物的灵敏检测具有重要意义。

  近期,日本国立材料科学研究所(NIMS)功能材料研究中心Masanobu Iwanaga报道了一种高效的荧光传感平台,并展示了全介电的表面荧光生物传感器能够以pg/mL或数十飞摩尔的极低浓度直接检测具有代表性的抗体免疫球蛋白G(IgG)。此外,该荧光传感平台也可以有效地检测标准癌标志物抗原(例如癌胚抗原),检测浓度远低于医学诊断标准的5 ng/mL。重要的是,超表面生物传感器在人血清中进行目标物检测能同时抑制不均一的荧光反应,并显示出高重现性和高灵敏度。该研究提出的超表面荧光生物传感器为灵敏检测目标物提供了一个实用平台,这可能是比商业标准的酶联免疫吸附测定更好的选择。相关成果以“All-Dielectric Metasurface Fluorescence Biosensors for High-Sensitivity Antibody/ Antigen Detection”为题发表在国际化学权威杂志ACS Nano上(DOI: 10.1021/acsnano.0c07722)。

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  首先,作者研究了绝缘体上硅纳米棒阵列SOI上的超表面的光学共振。作者优化了超表面的结构设计,以实现570-600 nm处最大的FL强度增强。图二显示了具有400 nm周期性(由205 nm直径的纳米棒组成)的SOI-纳米棒超表面的反射光谱。从空气侧传播到超表面的入射光设置为s偏振,电场矢量垂直于入射平面。SEM图像显示,具有200 nm厚度的顶部SOI层和375 nm厚度的中间掩埋氧化物(BOX)层的SOI衬底制造了SOI-纳米级超表面。所测量的超表面始终在700 nm附近出现大于90%的高反射率波段,高反射带来自每个SOI纳米线中的磁偶极子谐振。为了阐明在560–600 nm波长范围内与荧光强度增强相关的共振,图二显示了共振电磁(EM)场分布:磁场强度和电场强度|H|2和|E|2,分别在线性刻度上。当将入射平面波设置为两个分量的强度均为1.0时,磁场强度和电场强度的最大值分别为46.3和39.3,共振电磁场显着增强。在该过程中,电场强度有助于荧光分子中的电偶极跃迁,在SOI-纳米棒的最外层表面具有最大的电场强度,并有助于高度增强的荧光。

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  其次,为了揭示超表面传感器芯片的功能以及用作生物传感器的性能,作者进行了IgG的直接荧光检测。光谱和成像测量的测量设置分别如图三所示。在光谱测量中,使用数值孔径为0.2,工作距离为20 mm的物镜将532 nm处的入射光聚焦在超表面芯片上;在超表面芯片上将激发激光功率设置在0.15至0.27 mW的范围内;激光光斑小于超表面面积。所收集的荧光经过分束器(BS),然后将荧光耦合到光纤,到达单色仪,然后在配备有冷却单元以减少热噪声的电荷耦合器件(CCD)相机上进行检测。在荧光成像测量中,入射光通过一个带通滤光片,并被限制在515至540 nm的波段内。响应的荧光由消色差透镜收集,经过类似于光谱配置的BS和荧光带通滤波器,最后到达CCD摄像机。如图三所示,使用蛋白AG-Cys对被荧光分子标记的多克隆IgG Alexa Fluor 555(AF555)进行直接检测。IgG与蛋白质AG中的Fc结构域结合。将超表面芯片经过一系列处理后设置为光谱结构,并测量荧光。通过在570至580 nm的波长范围内积分荧光光谱来评估强度,并利用AF555-IgG的荧光强度以用于定量IgG浓度,测得的IgG浓度范围为5至2000 pg/mL。

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  图三、直接荧光检测IgG。

  (来源:ACS Nano)

  接着,为了验证超表面传感器的实际潜力,作者将其应用于低浓度p53 Ab的荧光检测。图四通过积分从570到580 nm的平滑光谱来评估荧光强度与p53 Ab浓度的关系。即使在50 pg/mL的低浓度下也能检测到p53 Ab,该浓度远低于对应于医学诊断标准的浓度。Hill方程提出的定性性质与IgG检测的情况类似,而解离常数KD比IgG小5.8倍,这表明p53 Abs比IgG更容易与结合蛋白AG-Cys解离。

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  最后,作者利用该传感器检测癌胚抗原(CEA)。抗原检测广泛应用的形式是Ab-antigen-Ab三明治结构。作者利用该荧光传感平台用于夹心法测定CEA浓度。作为结合分子,Cys-链霉亲和素被固定在SOI-纳米棒阵列的背面,然后与不同浓度的抗原孵育,通过多重结合产生荧光扩增。图五展示了0.1、1和10 ng/mL CEA浓度与荧光强度之间的关系。荧光标记的Ab流到了超表面之外,但超表面之外的荧光强度明显较弱,这表明非特异性的物理吸收在超表面之外得到了很好的抑制。针对目标CEA的浓度与荧光强度之间的关系,作者分析了整个超表面积的荧光强度分布。使用Hill方程的拟合曲线,该轮廓被很好地再现,并且表明检测是高度灵敏的,因为观察到饱和且线性下降的范围。由于当前对CEA的医学诊断标准为5 ng/mL,因此超表面传感器上的CEA检测非常精确,足以为医院和诊所进行的液体活检提供定量结果。该方法的LOD为0.85 pg/mL,当理想地抑制背景时,荧光测量可以检测低浓度的目标CEA。

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  小结:日本国立材料科学研究所功能材料研究中心Masanobu Iwanaga构建了一种高效的全介电的表面荧光传感平台,实现了对IgG、p53 Ab和CEA的高灵敏度荧光检测,可检测到的最低浓度远远低于医学诊断标准。作者证实了该超表面传感器对包括人血清在内的实际液体活检模型缓冲液表现出鲁棒的响应。除了高灵敏度外,超表面荧光传感器还具有高重复性和定量检测功能,而其他传感器通常无法保证这些功能。作为蛋白质检测的商业标准,常规ELISA的检测时间通常需要4个小时,而该超表面传感器在不到一个半小时的时间内提供了更好的灵敏度和更高的通量,并且还可以通过清洗重复使用,降低检测成本。该研究为用于开发快速检测疾病标志物的装置提供了新的思路。

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