Biosensors & Bioelectronics:DNA原位自组装辅助的双药物靶点鉴定用于乳腺癌的联合治疗研究

生物医药技术 靶向药物技术
秦川    2021-01-07    602

  背景介绍

  乳腺癌是全世界女性最常见的恶性疾病,也是仅次于肺癌的癌症致死原因。尽管乳腺癌的发病率逐年增加,但从1989年到2017年,乳腺癌的死亡率已显着降低了40%,这主要归因于正确的诊断和治疗,尤其是靶向药物的使用。然而,对于某些特定的亚型,例如三阴性型乳腺癌(TNBC),患者除了有限的选择化疗以外,无法从现有的靶向治疗中受益。考虑到TNBC的高度异质性和耐药性,新的靶点不断被挖掘并用于新药开发,包括血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子受体(EGFR)、细胞间粘附分子1(ICAM-1)和程序性细胞死亡配体1(PD-L1)等,也希望能够通过多靶点的联合治疗在TNBC管理中获得临床益处。

  近期,上海大学赵婧教授课题组报道了基于DNA自组装技术的乳腺癌多治疗靶点分析的新方法,而相关成果以“Identification of dual therapeutic targets assisted by in situ automatous DNA assembly for combined therapy in breast cancer”为题发表在国际生物传感权威杂志Biosensors & Bioelectronics上(DOI: https://doi.org/10.1016/j.bios.2020.112913)。

  研究主要内容介绍

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  用于乳腺癌双治疗靶点鉴定的原位DNA自组装反应示意图

  (来源:Biosensors & Bioelectronics)

  为了鉴定共表达的表面生物标志物,作者制备了两种抗体连接的核酸探针: A@anti-EGFR和B@anti-ICAM-1。两种捕获探针选择性地识别表面生物标记物,并被固定在细胞膜表面。由三条DNA链A1、B1和C杂交形成的触发探针A1/B1/C,其包含捕获探针A的互补序列,触发了细胞膜上的第一轮链置换反应。随后,释放的双链B1/C与B@anti-ICAM-1互补,触发第二轮链置换反应并在细胞膜上留下双链产物B/B1。由于B1包含能够介导量子点(QDs)合成的短序列,因此在原位DNA自组装反应后,QDs被装载在细胞膜上。最后,双链体B/B1随着限制性内切酶作用从细胞膜表面收集释放,而收集到的QDs经过酸溶解后引起显著的电化学信号,可以反映双靶点在细胞膜表面的同时表达情况。

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  首先作者先鉴定了不同细胞表面的生物标志物表达情况。图1A显示了含有双靶点的TNBC细胞,其膜上同时阳性表达EGFR和ICAM-1。图1B和C显示了在不同的细胞系中评估EGFR和ICAM-1表面表达情况的流式细胞术和荧光结果,表明只有TNBC细胞株MDA-MB-231表面阳性表达EGFR和ICAM-1。图1D总结了表面生物标志物在不同细胞系中的表达。

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  图2A首先示意性地说明了组装过程中涉及的链置换反应。A与A1/B1/C中的A1杂交,启动第一轮链置换反应并释放B1/C,触发第二轮链置换反应,产生B1/B作为DNA自组装的最终产物。PAGE验证了在溶液中输入不同DNA探针时的逐步组装过程。图2B说明了在细胞表面的DNA组装的共聚焦显微镜成像结果:由于发生了双靶点辅助的链置换反应,在MDA-MB-231细胞周围可以观察到强烈的荧光,而在对照细胞表面几乎没有观察到荧光。总体而言,PAGE和荧光研究均证明了在TNBC中双靶点启动DNA自组装的可行性。

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  图3A描述了利用自组装反应表征双阳性细胞的“AND”逻辑门原理。图3B显示了不同DNA探针输入时的电化学反应:只有同时输入了A1/B1/C、A@anti-EGFR和B@anti-ICAM-1时,才能在MDA-MB-231表面获取高的电流响应。图3C显示了不同浓度靶细胞存在时的电化学响应结果。峰值电流随细胞浓度的增加而增加。靶细胞数量的增加促进了原位DNA自组装反应,从而在细胞膜上增加了QDs-B1的数量。图3D显示了峰值电流与细胞浓度的相关性,揭示了峰值电流与细胞数的对数值之间的线性关系。该方法的检测范围为每毫升1×102个细胞至5×105个细胞,检测限低至每毫升19个细胞,具有非常优异的灵敏度。

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  图4A显示了鉴别双阳性细胞筛选的特异性示意图。图4B显示了在不同细胞存在下的电化学反应。仅MDA-MB-231存在时可以观察到高峰值电流,而对照细胞仅能观察到低峰值电流。图4C以稀释的血清为例来模拟复杂环境。在血清样品中获得的峰值电流与在PBS中获得的峰值电流相当,证明了该方法具有令人满意的特异性和抗干扰能力。

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  最后,作者通过使用相应的抑制剂评估了联合治疗的治疗效果。图5A首先显示了在EGFR和ICAM-1抑制剂吉非替尼和甲基咪唑处理后MDA-MB-231的细胞活力。用吉非替尼或甲基咪唑处理后,细胞活力从100%分别降至44.9%和62.59%。但是吉非替尼和甲基咪唑同时加入后,显著降低至11.9%。图5B展示了药物处理期间的电化学响应。单药治疗组观察到峰值电流仅略有下降,而联合治疗组观察到明显的峰值电流下降。图5C显示了在单药或双药治疗下的相应抑制率,证明了电化学方法在药物治疗过程中监测细胞活力的可行性以及联合治疗的重要性。

  小结

  在本文中,作者设计了一种原位DNA自组装反应,用于鉴定TNBC表面同时存在的联合治疗靶点。电化学结果证明了该方法对TNBC中治疗靶点识别具有很高的敏感性和特异性,有望为靶向治疗的实施提供指导。鉴于乳腺癌的高度异质性和不断发现的乳腺癌治疗新靶点,通过设计更灵活的DNA组装模块,该方法将有望拓展应用于更多乳腺癌亚型的精准分型和靶点鉴定。

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