用于细胞表型追踪的荧光液滴细胞仪

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钱晓鹤    2020-12-18    641

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  剖析活癌细胞的异质表型是一项需要单细胞分析的关键能力。但是,当靶向少量细胞时,在活细胞的单细胞水平上获取信息是一项挑战。加拿大多伦多大学ShanaO。 Kelley教授课题组报告了一种通过荧光滴流式细胞术(FDC)对低丰度细胞进行单细胞分析的方法,该方法使用液滴微流控平台实现了生物标记物特异性酶促荧光分析。FDC利用液滴中的DNA功能化抗体来实现特定的细胞靶标检测,并能够根据其表面表型以单细胞分辨率表征和分析活癌细胞。使用这种方法,他们实现了用少量(<40个细胞)细胞集合获得的多个表面标记的活细胞表型分析。
图片.png  图1。 靶向PC-3细胞上CD44的DNA抗体偶联物设计和信号放大反应的验证。(A,B)Cy5标记的DNA缀合物和靶细胞之间特异性结合的表征。PC-3细胞的明场图像(BF),细胞DNA和细胞核的荧光图像(Hoechst),活力指示剂染色(钙黄绿素AM)细胞的荧光图像(Live)和Cy5-DNA产生的信号的荧光图像。在(A)中,抗CD44被省略;在(B)中,它共价附于DNA。(C)使用流式细胞术表征抗CD44-(DNA)29/PC-3结合。(D)FDC示意图,用于在单细胞上表征单表面标记。使用抗CD44-(DNA)29(1)靶向CD44标记。在该试验中,将约40个细胞与报告基因DNA(Alexa674-ab-Q)和NB。BbvCI切口酶混合,并封装在微流控设备的单细胞液滴中(2)。单细胞封装后,将小滴在37°C下孵育以诱导酶促荧光信号放大(3)。(E)含有和不含有DNA-抗体结合物特异性结合的单个细胞的液滴的荧光显微镜检测(亮场,活细胞染色和基于DNA的扩增荧光信号)。(F)检测不同CD44表达量的小滴荧光强度变化。(G)在活的单个PC-3细胞上CD44表达的FDC图谱。有关其他单元号的更多试验,请参见图S7。比例尺=10μm。
图片.png  图2。 使用标记分子在细胞表面从CD44到CD104的定向转移的双向标记分析策略。(A)在细胞表面定向DNA转移的示意图。附着在细胞表面的抗CD104-c'和抗CD44-c'*d'*e'/d'c'经历定向迁移(1)。需要燃料束(c7nt'*d'*)完成定向迁移(2)。(B)使用荧光从DNA44向CD104定向DNA迁移的动力学。(C)针对对照的荧光信号的定量(不存在c7nt'* d'*链并且不存在靶标标记)。误差棒代表标准偏差,n=3。
图片.png  图3。 活细胞双标记表型表征。(A)基于FDC的双标记阳性单细胞检测示意图。CD44和CD104标记物被抗CD44-DNA共轭物(抗CD44-c*d*e/dc)和抗CD104-DNA共轭物(抗CD104-c)靶向(1)。链(c*d*e)从CD44到CD104的定向迁移通过添加燃料链(c7nt*d*-(b*a*)29)完成(2)。将细胞与Alexa674-ab-Q和酶混合,用于产生单细胞液滴(3)。单细胞封装后,将小滴在37°C下孵育以诱导酶促荧光信号放大(4)。(B)含有(PC-3,CD44 +和CD104 +)细胞且不含(MCF7,CD44-和CD104+)细胞的液滴的荧光显微镜检查,包括DNA缀合物附着(亮场,活细胞染色和基于DNA的扩增荧光信号)。(C)使用液滴荧光强度从低到高说明CD104和CD44表型表达。(D)活的单个MCF7(灰色)和PC-3(黑色)细胞上CD104和CD44表达的FDC分析。请参见图S13,以了解其他单元号的更多试验。比例尺=10μm。

  DOI: 10。1021/jacs。0c05276

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