【生化】Angew:γ-谷氨酰转肽酶(GGT)激活的荧光探针用于持久的肿瘤成像

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CBG资讯    2020-12-17    1202

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  γ-谷氨酰转肽酶(GGT)广泛分布于肾、肝、胰腺等实质性脏器,且在几种类型的癌症中过表达,如原发性和继发性肝癌。现有的靶向GGT的荧光探针可以为这些癌症成像,但是在长时间的孵育或固定过程中,荧光水解产物会从目标癌细胞中泄漏出来。因此,需要一种新型的GGT荧光探针,其水解产物可以与目标酶以外的细胞内亲核试剂共价结合,从而可以使它们存在于细胞中而不影响目标酶的活性,既可实现敏感的癌症检测又可提供持久的信号。

  基于此,日本医东京大学的Yasuteru Urano教授和日本东京大学的Mako Kamiya博士设计并合成了一种识别GGT的功能化荧光探针4-CH2F-HMDiEtR-gGlu,该探针在GGT激活过程中生成氮杂醌甲基化物中间体。该中间体与细胞内亲核试剂反应,生成荧光加合物,被捕获在细胞内,而不会影响目标酶的活性。同时,该探针在异种移植(PDX)小鼠体内可使癌症成像时间延长,并且实现癌症组织的固定和免疫染色。相关内容以“?γ-Glutamyltranspeptidase (GGT)-Activatable Fluorescence Probe for Durable Tumor Imaging”为题发表在Angew。 Chem。 Int。 Ed。上(DOI: 10。1002/anie。202013265)。

  首先,作者选择了先前报道的罗丹明衍生物HMDiEtR(羟甲基二乙基罗丹明)作为核心荧光团,将γ-谷氨酰基部分作为酶底物,和HMDiEtR的氧杂蒽第4位氟甲基化后相连,设计了4-CH2F-HMDiEtR-gGlu。酶催化的γ-谷氨酰基部分水解会释放出氟离子,从而产生氮杂醌甲基化物中间体(?Figure 1a)。

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  (来源:Angew。 Chem。Int。 Ed。)

  为了证实该探针设计的可行性,作者制备了4-CH2F-HMDiEtR-gGlu和4-CH2OH-HMDiEtR,作为模型反应产物(?Figure 1a),并评估了它们在水溶液中的光物理性质。作者测量了各种pH条件下反应产物的吸光度和荧光光谱,并绘制了最大值,以计算pKcycl值(?Figure 1b)。结果4-CH2F-HMDiEtR-gGlu的pKcycl值为5。8,这表明4-CH2F-HMDiEtR-gGlu在pH 7。4的生理pH下将主要以无色的螺环形式存在。相比之下,4-CH2OH-HMDiEtR的pKcycl值为9。6,表明它在pH 7。4下主要以有色的荧光开放形式存在。此外,作者还证实了在体外与GGT反应后,4-CH2F-HMDiEtR-gGlu转化为4-CH2OH-HMDiEtR,并且该反应伴随可见光区域的吸收和荧光的恢复(?Figure 1c, d)。

  接着,作者评估了4-CH2F-HMDiEtR-gGlu在细胞内的残留情况,并与先前报道的gGlu-HMRG相比较。作者将两种探针分别用于SHIN3细胞(高GGT活性),并在清洗以及与培养基孵育前后捕获荧光图像,然后用4%多聚甲醛(PFA)固定细胞(?Figure 2a, b)。结果显示,与gGlu-HMRG相比,洗涤或固定后4-CH2F-HMDiEtR-gGlu的酶反应产物保留得更好。

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  (来源:Angew。 Chem。Int。 Ed。)

  最后,作者将源自患者的肿瘤组织植入小鼠体内,研究了4-CH2F-HMDiEtR-gGlu在体内癌症成像中的适用性(?Figure 3)。作者将探针皮内注射到患胰腺癌的PDX小鼠模型中,并使用IVIS荧光成像系统观察了活体小鼠中的荧光信号。由图可见,经gGlu-HMRG和4-CH2F-HMDiEtR-gGlu处理后,均可观察到荧光激活。但在前一种情况下,荧光产物迅速从肿瘤部位漏出,产生非特异性背景信号;而4-CH2F-HMDiEtR-gGlu表现出更持久的信号和较高的肿瘤与背景(T/B)信噪比(Figure 3a, b)。使用共聚焦显微镜观察活体小鼠的肿瘤组织,观察结果证实了gGlu-HMRG和4-CH2F-HMDiEtR-gGlu均表现为肿瘤特异性荧光信号,尽管前者的信号迅速降低(?Figure 3c)。另外,为了探究所获得的荧光信号的稳定性,作者在注射后4小时切除肿瘤组织,并用0。2% PFA固定,依次浸泡在15%蔗糖和30%蔗糖溶液中,冷冻并切片。用APC抗原HLA对切片进行免疫染色,以靶向人癌组织。结果发现,4-CH2F-HMDiEtR-gGlu获得的荧光信号被很好地保留,并与HLA免疫染色很好地共定位;而在gGlu-HMRG作用的情况下,由于该过程中的渗漏,未观察到荧光信号(?Figure 3d)。

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  (来源:Angew。 Chem。Int。 Ed。)

  总而言之,作者设计并合成了一种新型可激活的具有细胞内滞留性的GGT荧光探针4-CH2F-HMDiEtR-gGlu,其在与酶反应后显示出显著的荧光激活作用,并通过反应保留在靶细胞内,而不会影响靶酶活性。这对于评估肿瘤新药的功效和药代动力学具有重要的意义。

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