单克隆抗体的电荷异构体
电荷异构体是单克隆抗体（mAb）的关键质量参数（CQA）之一，在药品稳定性研究、申报及放行等环节都必须检测、评估。单抗电荷异构体在生产过程中历经多种酶促翻译后修饰，例如糖基化和赖氨酸切断。此外，在纯化和储存过程中可发生多种化学修饰，例如氧化或脱氨。电荷异构体可能具有明显不同的生物活性，影响单抗药物的功能、安全性及稳定性。导致电荷异质性的最常见变异之一是C末端赖氨酸剪切，随着一个或两个带正电荷的赖氨酸残基丢失，可导致碱性变异体的形成；另外，在N-和O-连接的聚糖上脱酰胺、糖化和带负电荷的唾液酸的存在都会导致负电荷增加和酸性变异体的形成。异质体的产生会造成电荷异质性，一方面对重组单克隆抗体的稳定性和生物学活性具有重要影响；另一方面，电荷异质性的程度也反映了单克隆抗体生产工艺的一致性。
这种异质性也可以宏观表现为：在等电聚焦电泳图上出现弥散或多个条带；离子交换色谱图主峰前后出现小峰。这是由于抗体分子所带电荷差异造成的异质性，所以，这种现象也被称为抗体的电荷变异。
图1：单抗电荷异构体在等电聚焦电泳图上的宏观表现
QbD-从源头控制电荷异构体的产生
➤基于QbD理念，从源头控制，一些研究已表明，在培养过程中控制铜离子的浓度、 降温、增加培养时间能有效降低C-末端赖氨酸变体。
➤由于N-末端谷氨酰胺/谷氨酸环化作用多是自发反应，因此对其的控制策略应在制剂工艺开发和稳定性试验的过程中加以考虑，以利于选择最佳制剂配方及储存条件。
➤通过控制培养液中的丁酸钠、渗透压、CO2 来控制抗体的唾液酸化修饰程度。细胞可从培养液中的糖蛋白获取唾液酸，再将这些唾液酸基团 结合到自身的糖蛋白中。
➤在单抗生产工艺、制剂配方的开发及储存条件的研究中，应尽量选择合适的条件，以减少抗体的氧化降解以此减少电荷异构体的产生。
➤天冬酰胺脱氨基／天冬氨酸异构体在恒定区和可变区均有发生，且在抗体生产、纯化、储存甚至注射到体内的过程中均有发生。当脱氨基作用发生在抗体可变区时，就可能会对抗体的结合活性产生一定影响。在抗体储存过程中，高温和pH均会加快降解发生，因此，在选择制剂配方时，要选择合适的制剂以及储存温度。在发酵生产过程中所产生的天冬氨酸降解多于整个货架期内产生的，因此，在选择抗体表达序列时，可选择带有更少热点的序列，以减少在生产工艺过程中的天冬酰胺脱氨基和天冬氨酸异构化。
➤克隆抗体具有多个链内和链间二硫键。人IgG的4种亚型的不同就在于链间二硫键桥的数量和空间结构不同。未配对和错配的二硫键均会引起抗体结构的变异，从而导致抗体表面电荷分布发生改变。二硫键相关的异质性主要发生在发酵工艺过程中，通过调节培养条件或细胞内的氧化还原状态可显著减少这些变体。
单抗电荷异构体的分离
➤阳离子交换层析（流穿模式）
阳离子交换层析被广泛用于酸性电荷异构体的分离，阳离子交换层析是，选择合适的条件（pH和电导率）让酸性异构体流穿，结合合适的上样量，即可从单抗样品中高效去除酸性电荷异构体。推荐层析介质：SP Large Scale HP及Seplife LXMS-30S/15S等高分辨率高载量离子阳离子交换介质。
➤阳离子交换层析（吸附洗脱模式）
离子交换洗脱时盐梯度在电荷异构体分离上分辨率较低，此时，也可以采用pH梯度的方式进行洗脱，pH梯度洗脱利于电荷异构体的去除。
➤多模式层析（吸附洗脱模式）
多模式层析（强阴离子交换多模式层析MA Large Scale HP及弱阳离子交换多模式层析MMC Large Scale)时，采购高通量层析工艺开发方式，快速的确定结合条件，并进行初步工艺的开发，采购pH伴随盐双梯度的洗脱模式，可以提高多模式层析的分辨率，进而提高单抗中电荷异构体的去除率。
图2：吸附层析填料高通量筛选方法
参考资料
1.Lee HJ, Lee CM, Kim K, Yoo JM, Kang SM, Ha GS, et al. Purification of antibody fragments for the reduction of charge variants using cation exchange chromatography. Journal of chromatography B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences. 2018;1080:20-6.
2.抗体电荷异质体形成机制（抗体君20190825）
3.Krystian Barana,Patrycja Zimochb,Artur Stańczakc Wojciech,Piątkowskia Dorota Antos.Journal of Chromatography A Volume 1658, 22 November 2021, 462607
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黄教授
