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超螺旋质粒DNA GMP条件纯化手册

制药技术 医药技术
生物制药合伙人    2022-07-19    898


简介

超螺旋质粒DNA (scDNA)是DNA重组技术中常用的载体。载体是指把一个有用的外源基因通过基因工程手段,送进受体细胞中去进行增殖和表达的工具。将某种目标基因片段重组到质粒中,构成重组基因或重组体。然后将这种重组体经微生物学的转化技术,转入受体细胞(如大肠杆菌)中,使重组体中的目标基因在受体菌中得以繁殖或表达,从而改变寄主细胞原有的性状或产生新的物质。

随着mRNA药物,细胞及基因治疗的发展,质粒DNA得到广泛的应用。质粒DNA也可作为核酸药物单独使用,也可以作为在重组病毒载体生产中作为病毒包装的原料。质粒DNA的广泛应用使得GMP级别大规模生产需求急速扩增


scDNA的制备

2.1.大肠杆菌高密度发酵

常用BL21用改良TB培养基高密度发酵,通过补料及过程控制,通常培养20-24 h,OD600可到150-180左右。

2.2. 菌体收集

根据发酵液的体积可以选择离心或者0.1-0.2um的切向流过滤膜组件进行菌体收集和清洗。

2.3. 菌体裂解

离心收集的菌体重悬后的菌液或者切向流过滤膜组件收集的菌液加入0.2M NaOH 1% SDS处理4-10min,注意加入碱后要缓慢搅拌。碱裂解的过程要注意碱的加入方式及接触时间,既要保证菌体充分裂解又要保证裂解后pDNA的收率,避免不可逆损伤的发生而影响回收率。

2.4. 裂解液中和

   用3M KAc pH5.5 中和裂解液,30min。

2.5. 裂解液澄清

   中和后的裂解液用离心加深层过滤或者用离心加TFF膜组件进行澄清处理,去除固形物。

2.6. UF/DF

   澄清后的裂解液用TFF膜组件UF/DF,减少体积并去除部分杂质,减少层析纯化阶段的负荷。根据pDNA的大小选择不同膜孔径的TFF进行UF/DF,通常pDNA是1Kbp 时选择100 KDa 的膜孔径而大于10 Kbp 时选择500 KDa 的膜孔径。


scDNA的层析纯化

 scDNA溶液中HCP,RNA,ocDNA及内毒素都是层析工艺阶段要去除的杂质,质粒大小、序列、表达量、稳定性、杂质含量等的差异影响层析纯化过程,随着技术的发展scDNA纯化也呈现多种工艺路线。在众多的质粒纯化工艺中,经典的凝胶过滤-Plasmid 亲和层析-Q 阴离子交换层析已被证实是稳健且合理的,并广泛用于scDNA的 GMP条件制备。

3.1凝胶过滤层析——去除RNA

pDNA 和 RNA 的分子量相差较大,同时在高浓度硫酸铵条件下,RNA会积聚与pDNA在分子尺寸上区别更显著,此时凝胶过滤是组群分离,组群分离模式使凝胶过滤层析时的上样量可以达到0.2-0.3 CV,pDNA 通过层析柱的外水体积首先流出,而RNA等其它分子后面流出。

pDNA纯化凝胶过滤介质:Seplife 6FF

缓冲液:2.1M(NH4)2 SO4,10mM EDTA,100mM Tris-HCl,pH 7.5

上样量:0.25 CV

3.2嗜硫亲和层析——去除ocDNA

scDNA 为双链的共价闭环结构,而在发酵及裂解操作中一条链的断裂会导致分子螺旋性的消失并产生 ocDNA。ocDNA 与 scDNA 分子性质高度类似,区别在于scDNA 具有更高的碱基暴露程度和表面电荷。Seplife Plasmid LX 介质利用配基的嗜硫吸附即亲水-疏水多模式作用,利用电子供体和电子受体之间的相互作用来分离纯化生物分子,用于高效区别scDNA与ocDNA 的细微差别,在高盐环境下scDNA和ocDNA 都和Seplife Plasmid LX结合,因scDNA具有更高的碱基暴露程度和表面电荷,其和Plasmid亲和介质的电子供体和电子受体之间的作用力更强,这种作用力在高盐环境下得以加强,在低盐环境下减弱,故在合适的盐浓度上样,ocDNA流穿,而scDNA结合在介质上从而实现分离,同时要注意的是,对于大小和序列不同的质粒,纯化的最佳条件略有区别。

scDNA纯化亲和介质:Seplife Plasmid LX

平衡液:2.0M(NH4)2SO4,10mM EDTA,100mM Tris-HCl,pH 7.5

洗脱液:0.3M NaCl,1.7M(NH4)2SO4,10mM EDTA,100mM Tris-HCl,pH 7.5

注意:不同序列及大小的质粒,纯化时缓冲液及载量要适当的调整。


3.3. 阴离子交换层析——去除内毒素

    经过前2步层析后,scDNA溶液HCP,RNA,ocDNA及内毒素被大量去除,痕量的内毒素及HCP在用高分辨率阴离子交换层析介质Seplife LXMS-30 Q或者Q Large Scale HP去除。scDNA高密度负电荷的特性,使其在较高(如0.4 M NaCl)的盐浓度下,仍结合在阴离子交换介质上,而内毒素在高盐条件下不和阴离子交换介质结合,从而实现内毒素的去除。

    阴离子交换介质:Seplife LXMS-30 Q或Q Large Scale HP

    平衡液:0.4M NaCl,10mM EDTA,100mM Tris-HCl,pH 7.5

洗脱液:1.0M NaCl,10mM EDTA,100mM Tris-HCl,pH 7.5

                                             


scDNA其它纯化工艺路线

澄清后的pDNA溶液也可用Seplife Suncore 700多模式层析介质纯化,pDNA溶液流经柱床时,pDNA通过外水体积流穿,而RNA,HCP,内毒素等进入填料的核心区域并以静电力及疏水作用力和填料结合,从而实现RNA和内毒素的去除,后在经Seplife Plasmid LX亲和层析纯化,去除ocDNA即可。同时也可以通过疏水层析及盐析的方式去除RNA及ocDNA。相比三步层析纯化质粒的平台,其它工艺路线需要更多摸索结合条件及洗脱条件。


scDNA纯化相关层析介质
 

产品牌号

货号

包装规格

Seplife  

6FF

A1003202

25ml

A1003203

100ml

A1003204

500ml

A1003205

1L

A1003206

5L

A1003207

10L

产品牌号

货号

包装规格

Plasmid   

Seplife LX

A4690102

25ml

A4690103

100ml

A4690104

500ml

A4690105

1L

A4690106

5L

A4690107

10L

产品牌号

货号

包装规格

Seplife

LXMS-30Q

PS103231X(30)-1

25ml

PS103231X(30)-2

100ml

PS103231X(30)-3

500ml

PS103231X(30)-4

1L

PS103231X(30)-5

5L

PS103231X(30)-6

10L

产品牌号

货号

包装规格

SP 

Large Scale 

HP

A2066402

25ml

A2066403

100ml

A2066404

500ml

A2066405

1L

A2066406

5L

A2066407

10L

产品牌号

货号

包装规格

Seplife 

Suncore 700

A5090502

25ml

A5090503

100ml

A5090504

500ml

A5090505

1L

A5090506

5L

A5090507

10L

产品牌号

货号

包装规格

Phenyl Large Scale

A3063202

25ml

A3063203

100ml

A3063204

500ml

A3063205

1L

A3063206

5L

A3063207

10L

注册人名称/生产企业:西安蓝晓科技新材料股份有限公司

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