1.课题来源与背景本课题来源于广西科技厅青年基金项目。山桔叶是芸香科山小橘属Glycosmis Correa植物小花山小橘Glycosmis parviflora （Sims） Kurz 的叶主产于福建、广西、云南等地。山桔叶是两广地区的常用药材,收载于《广西壮族自治区壮药质量标准》、《中国植物志》、《中华本草》等著作。气味芳香,具有散瘀消肿、化痰消极、祛风解毒的功效。壮医认为山桔叶可通龙路火路,调气道谷道,可用于治疗食滞、胃痛、感冒、咳嗽、跌打损伤等症。临床上山桔叶外敷治疗急性踝关节扭伤具有良好的治疗效果。山桔叶也用于成药的生产,是中华跌打丸的主要成分之一,目前对山桔叶的相关研究较少,本课题从化学成分、抗炎镇痛作用、质量评价等方面开展研究。 2.研究目的与意义 本项目采用化学、药理学、波谱解析等多学科知识,探讨山桔叶抗炎作用并对其化学成分进行研究,建立山桔叶质量评价方法。通过小鼠耳肿胀、大鼠足肿胀、毛细血管通透性、棉球肉芽肿实验、扭体实验、热板实验等体内抗炎、镇痛实验,筛选山桔叶抗炎、镇痛活性部位,采用现代化学提取、分离、纯化技术对活性部位化学成分进行分离得到单体化合物9个,结合体外抗炎实验,选择TNF-α、IL-6、IL-1为体外抗炎活性指标,通过酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测TNF-α、IL-6、IL-1含量,考察单体化合物的抗炎活性,筛选活性化合物,应用波谱分析技术解析化合物结构,确定活性成分,初步明确山桔叶发挥抗炎作用的物质基础,同时开展山桔叶质量控制相关研究,提高山桔叶质量控制标准,为山桔叶的进一步开发、研究提供基础。 3.主要论点与论据 （1） 山桔叶急性毒性研究 山桔叶水提物最大耐受量为218.2g/kg,醇提物最大耐受量为214.6g/kg,临床使用安全。 （2）山桔叶抗炎镇痛实验研究 山桔叶水提物、醇提物均有良好镇痛抗炎作用,均可减少醋酸致小鼠扭体反应次数,提高热板致小鼠疼痛的痛阈值;抑制二甲苯致小鼠耳廓肿胀度,1%角叉菜胶致小鼠炎足肿胀,1%角叉菜胶致小鼠炎足PGE2产生,0.6%冰醋酸致小鼠腹腔通透性增加及小鼠棉球肉芽肿产生。 （3）化学成分研究 ①非挥发性成分研究 本项目综合采用TCL、硅胶柱色谱、大孔树脂及Sephadex LH-20等现代色谱分离技术,从山桔叶中分离纯化得9个成分,木栓酮、山柑子萜醇、异山柑子萜醇、棕榈酸、琥珀酸、β-谷甾醇、胡萝卜苷、豆甾醇、牡荆素,9个成分均是首次从山桔叶中分离发现。 ②挥发油成分研究从6批不同产地的山桔叶中提取出10个共有成分,分别为α-荜澄茄烯、α-蒎烯、β-波旁烯、β-榄香烯、β-石竹烯、α-石竹烯、大根香叶烯 D、β-甜没药烯、（-）-桉油烯醇、t-杜松醇。不同产地对山桔叶挥发油组成有较大差异,但均以β-石竹烯的含量最高。 （4）山桔叶中活性成分牡荆素抗炎作用研究 考察牡荆素对LPS诱导的RAW264.7细胞IL-1、IL-6、TNF-α含量的影响,结果表明,40 mg/L牡荆素给药组可使IL-1、TNF-α含量降低。 （5）山桔叶质量控制研究 采用基源鉴别、性状鉴别、显微鉴别、薄层色谱鉴别的方法对山桔叶进行鉴别研究;对山桔叶的水分、总灰分、酸不溶性灰分及浸出物进行测定;以山桔叶中牡荆素为指标性成分,采用薄层色谱法（TLC）山桔叶进行定性鉴别和定量分析。10批山桔叶样品水分为7.84%~15.97%、总灰分为8.05%~10.82%,酸不溶性灰分为0.24%~1.01%,浸出物含量为17.64%~25.82%。所建立的方法稳定可靠,可为山桔叶药材质量标准的制定提供实验依据。 4.创见与创新首次进行山桔叶抗炎镇痛实验研究,并分离得到9个化合物均首次从山桔叶中分离得到,进行质量评价研究,并考察了牡荆素的抗炎活性,探究山桔叶发挥抗炎作用的物质基础,为山桔叶的进一步深入开发及利用奠定基础。 5.社会经济效益及存在的问题通过项目研究完成“壮药山桔叶抗炎作用物质基础研究”研究报告,在学术期刊发表论文4篇,其中核心期刊2篇,培养硕士研究生1人,本科生2人。项目对山桔叶抗炎作用、化学成分、活性成分及质量评价等进行研究,丰富了壮药的研究成果,为山桔叶及其相关成药的进一步开发和研究提供基础。 在抗炎活性成分研究过程中曾考察多种溶剂,采用多种方法使分离纯化得到的化合物进行溶解,部分化合物无法溶解,此外,分离纯化后有些化合物得到的量较少,无法进行体外抗炎实验研究。山桔叶化学成分与其药效之间的相关性有待进一步开展深入系统研究,以探究其物质基础,其抗炎作用机制亦有待开展深入研究。