导读： 2019年11月1日，Nano Letters杂志以“Cancer-Cell-Membrane-Coated Nanoparticles with a Yolk-Shell Structure Augment Cancer Chemotherapy”为题，在线报道了中科院上海药物研究所的最新研究成果。疾病治疗中，仅依赖药物分子在体内的自由扩散会导致药物体内分布不均且产生的疗效十分有限，需要借助载体才能实现高效输运。对于肿瘤治疗而言，载药纳米粒的体内输运过程十分复杂，若想到达靶部位实现良好的抗肿瘤效果，必须克服体内一系列生理屏障，包括血液循环、肿瘤部位蓄积、肿瘤组织穿透、癌细胞摄取以及细胞内药物释放等。同时也应注意到现阶段很多化疗药物都是基因毒性药物，需要到达细胞内的特定细胞器——细胞核才能发挥治疗作用。因此，将药物高效递送至细胞核对于提高基因毒性化疗药物的治疗效果至关重要。图1. 癌细胞膜包被的蛋黄壳纳米载体的制备示意图。 针对克服肿瘤递药的多重生理屏障，前期研究中，中国科学院上海药物研究所甘勇研究员及合作团队结合超高分辨显微镜和分子动力学模拟技术，发现刚度适中的纳米粒具有适宜的形变能力，易于形变为棒状或椭球状，有利于穿越肿瘤间质生物凝胶，提高递药效率。图2. 蛋黄壳载体在肿瘤间质中的运动（A）、FRET效应验证其膜融合入胞（B）、快速的胞内转运（C）、载体的细胞内定位（D）以及所载药物（阿霉素）的细胞内定位（E）。 启发于包膜病毒可与宿主细胞发生膜融合，释放内部核衣壳结构进入细胞质并最终锚定在核孔周围释放核酸分子进入细胞核的高效侵袭途径，科研人员在现有的癌细胞包被型载体的基础上进行了载体结构的创新，设计了一种癌细胞膜包被的蛋黄壳纳米载体，并包载基因毒性药物阿霉素和中科院上海药物研究所自主研制的PARP抑制剂美呋派瑞（mefuparib hydrochloride，抑制基因修复）。研究发现该载体具有一般癌细胞包裹纳米载体所共有的免疫逃逸和肿瘤靶向作用，同时适中的刚性使其在肿瘤间质中可形变为椭球状从而加速其在肿瘤组织内的穿透。值得注意的是，该蛋黄壳载体还可模拟包膜病毒的侵袭途径，即通过膜融合入胞，释放内部核心进入细胞质，该“蛋黄”可在胞浆中快速运动并聚集于核周，实现药物高效协同入核，最终提高抗肿瘤效果。这些发现将有助于科学家们进一步开发能够克服递药多重屏障的高效药物载体。图3. 蛋黄壳载体克服肿瘤递药多重生理屏障的体内转运过程。 该研究工作是在甘勇研究员的指导下，由研究生聂迪、代卓和上海中医药大学本科生李佳霖等人协作完成，同时也得到了国家自然科学基金和中科院战略性先导科技专项的资助。论文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.nanolett.9b03817

关键词：药物,载体,肿瘤,蛋黄,癌细胞,细胞,纳米,体内,高效,克服

导读： 2月22日，中国科学院上海巴斯德研究所酒亚明课题组在PNAS上，发表了题为Host cytoskeletal vimentin serves as a structural organizer and an RNA-binding protein regulator to facilitate Zika viral replication的论文。该研究利用多种显微成像技术和组学分析，首次阐述了中间丝波形蛋白vimentin在寨卡病毒感染中的物理空间支撑与生物功能调控的双重作用。寨卡病毒（Zika virus，ZIKV）是带包膜的单链正义RNA的黄病毒属病毒，该病毒导致新生儿小头畸形、格林-巴利综合征等神经性疾病。ZIKV进入胞内后会在内质网膜复制，产生大量双链RNA、病毒基因组RNA和病毒蛋白，这些病毒组分和被劫持的宿主因子一起在核周聚集形成病毒复制工厂以提供高效的病毒复制，而该过程中发生剧烈重构的宿主细胞骨架发挥怎样的生物功能尚不清楚。细胞骨架包括微丝、微管和中间丝，三者互相交织形成网络为细胞内提供机械支撑，参与细胞器定位、物质运输、信号传导等重要生物过程。波形蛋白（vimentin filaments）属于细胞骨架中间丝，主要围绕细胞核向细胞边缘辐射状分布。近年来，有研究发现vimentin filaments在病毒感染中会发生重构向核周聚集，但其在ZIKV感染过程中的动态变化及其生物功能尚不清楚。此外，细胞骨架蛋白还可参与调节胞内转录翻译机器。然而，中间丝vimentin与胞内转录翻译机器之间的物理空间和生物功能上的关系尚不清晰，尤其在病毒感染情况下，vimentin filaments与病毒复制工厂形成的联系完全未知。研究利用共聚焦显微镜、活细胞实时观察、超高分辨率显微镜和电镜等生物成像技术，观察到随着ZIKV感染时间的延长，细胞内vimentin filaments逐渐向核周聚集，形成笼状结构以包裹病毒复制工厂组分如dsRNA、NS4B和Env（图1），内源表达病毒蛋白Env也能诱导vimentin filaments产生类似的现象。以往研究报道了vimentin filaments在多种病毒感染中均会出现类似重构现象，为了进一步探究这一变化的具体意义和机制，科研人员利用CRISPR/Cas9技术敲除人骨肉瘤细胞系U2OS和人肝癌细胞系Huh7中的vimentin后，发现病毒复制工厂组分NS4B、Env或dsRNA的胞内定位由核周聚集变为呈多块分散，并使病毒RNA复制、蛋白合成、子代病毒产生量和整体感染率均显著降低。只有在敲除细胞中回补全长vimentin才能使病毒复制工厂在被vimentin filaments的包裹下重新向核周聚集成团，回补只能形成八聚体（unit length of filaments，ULF）不能成丝的vimentin不能挽救其分散表型。研究发现，ZIKV感染后细胞内另一中间丝巢蛋白（nestin filaments）和波形蛋白一起发生了向病毒复制工厂聚集的变构，但单敲除nestin基因并不影响ZIKV的复制，而单敲除vimentin影响nestin的表达与病毒复制工厂的定位。结果表明，vimentin保证了ZIKV复制工厂的高密度核周聚集，是病毒高效感染的必要条件，且其功能在细胞多种中间丝中具备独特性和重要性。为了探索vimentin具体影响了ZIKV病毒感染的哪些步骤，研究人员在野生型和vimentin敲除细胞系中展开了不同感染时间点实验，以及病毒结合/进入细胞实验，结果发现敲除vimentin不影响ZIKV结合或进入细胞，却使病毒蛋白积累量持续低于野生型细胞。为了辨别这种病毒蛋白的降低是合成减少还是降解增加，研究分别在两种细胞内过表达病毒Env-EGFP和NS4B-EGFP蛋白，并分别用蛋白合成抑制剂cyclohemide（CHX）、蛋白酶体抑制剂MG132、溶酶体抑制剂NH4Cl处理，发现vimentin影响病毒蛋白合成而非降解。vimentin filaments正常情况下和ZIKV感染情况下的细胞内定位与内质网高度重合，且敲除vimentin使内质网分布更加扩散，这提示vimenitn和内质网之间存在重要联系。研究利用质谱结果进行蛋白质组学分析发现胞内vimentin和大量位于内质网的RNA结合蛋白（RNA-binding proteins，RBPs）存在互作。进一步RNA测序组学分析发现，相对于野生型细胞，vimentin敲除细胞感染病毒后大量内质网相关的具备双链RNA结合功能和转录调节功能的基因表达发生显著下调，这进一步印证了vimentin参与寨卡病毒RNA复制过程。综合两种组学分析结果，研究聚焦于内质网上一跨膜蛋白核糖体结合蛋白1（ribosome-binding protein 1，RRBP1），并利用蛋白质体外结合实验（pull-down assay）验证了vimentin和RRBP1相互作用。2019年，有研究报道了RRBP1能直接结合病毒RNA从而帮助黄病毒复制，缺失RRBP1基因使胞内寨卡病毒RNA水平下降约40%。为了剖析vimentin和RRBP1分子在ZIKV感染中的关系，研究在野生型细胞和vimentin敲除细胞中分别敲低RRBP1基因表达，观察两者胞内表达和定位情况，并对比ZIKV在其中的感染情况。结果发现，缺失vimentin使RRBP1在mRNA和蛋白质水平均下降约50%，且RRBP1和内质网信号在胞内定位更加分散，出现了类似病毒复制工厂分散的现象；RRBP1与内质网共定位关系不变，但RRBP1与ZIKV dsRNA共定位水平显著下降。这说明vimentin对于ZIKV感染后内质网的精细变构发挥重要作用，使病毒复制工厂保持致密结构，并聚集其余宿主分子如参与病毒转录翻译的ER相关蛋白使其保持高效复制。反之，RRBP1敲低却不影响vimentin的转录翻译水平和胞内定位。单独敲除vimentin使病毒复制下降的水平远大于单独敲除RRBP1，且和双敲除的抑制效率类似，这表明vimentin或作为RRBP1上游分子调控其参与病毒RNA复制过程。该研究揭示了在受到寨卡病毒感染后，细胞中间丝波形蛋白网络会逐渐向核周聚集形成笼状结构包裹病毒复制工厂，汇聚重要的宿主因子和病毒组分，与众多内质网蛋白互作如RRBP1以促进病毒RNA复制，从而同时在物理空间和生物功能上帮助病毒在胞内形成完整致密的病毒复制工厂以促进病毒产生，这提示vimentin可作为ZIKV感染治疗的潜在宿主靶点。研究工作得到中科院生物物理研究所、分子细胞科学卓越创新中心及芬兰Abo Akademi University科研人员的支持。论文链接 图1.Vimentin filaments围绕ZIKV病毒蛋白形成笼状结构图2.Vimentin filaments在ZIKV病毒感染过程中作为“结构支撑”和“调节因子”的双重功能

关键词：病毒,vimentin,复制,细胞,ZIKV,RRBP1,RNA,蛋白,filaments,工厂

导读： ［本站讯］近日，药学院赵保兵教授、沈月毛教授团队联合基础医学院李坚教授团队在Advanced Science杂志（中科院JCR期刊1区，五年IF=16.12）在线发表题为“Fine-tuning of cholesterol homeostasis controls erythroid differentiation”的研究论文，发现胆固醇异常导致贫血，揭示了胆固醇稳态调控红细胞发育的新分子机制。赵保兵教授、沈月毛教授和李坚教授为该论文共同通讯作者，药学院博士生卢志远和基础医学院硕士生黄丽霞为论文共同第一作者，山东大学为第一单位和唯一通讯单位。哺乳动物红细胞发育始于骨髓中的造血干细胞，在促红细胞生成素(EPO)作用下红系祖细胞依次分化为原红、早幼、中幼、晚幼红细胞，然后脱去高度固缩的细胞核分化为网织红细胞。网织红细胞通过自吞噬清除细胞器后完全成熟为红细胞(RBC)释放入血液中。红细胞发育异常导致多种疾病发生，包括地中海贫血、镰刀型红细胞贫血、戴-布二氏贫血(DBA)和红细胞增多症等。近年来多个信号通路和分子机制被发现参与红细胞发育调控，但目前仍存在许多未完全解决的难题，比如早期细胞经3-5次快速分裂增殖后如何脱离细胞周期，细胞核和染色质的高度固缩，以及末端脱核的分子机制等。 胆固醇是细胞膜的重要组成成分，在多种生理功能中发挥着重要作用。多项研究提示，胆固醇代谢与红细胞水平存在相关性。然而，胆固醇调控红细胞发育的分子机制尚不清楚。研究人员首先通过追踪体内和体外红细胞发育，发现红细胞发育成熟过程中细胞内胆固醇水平逐渐降低。发育早期的高水平胆固醇为细胞快速分裂增殖提供保障，随着关键转录因子GATA1表达上调，其结合并抑制SREBP2（胆固醇合成的关键转录因子），导致胆固醇生物合成下调，是导致细胞内胆固醇水平降低的主要原因。研究人员进一步通过RNA-seq发现，胆固醇水平的下调抑制mTORC1活性和核糖体生物合成，导致p53激活，从而促使细胞周期脱离。因此，发育后期低水平胆固醇可作为细胞增殖的制动器，促进红细胞从增殖向分化转换，这对于红细胞终末脱核至关重要。扰乱细胞内胆固醇稳态在体内和体外均损伤红细胞正常生成并导致贫血。同时，除了调控经典的胆固醇合成通路，团队首次发现SREBP2通过直接结合启动子区域调控GATA1辅因子NFE2的表达，形成一个负反馈通路来抑制珠蛋白的表达，保护晚期红细胞免受珠蛋白过度生成的毒性。该工作通过体内和体外研究证实了GATA1通过SREBP2调控胆固醇水平以及红细胞发育关键基因NFE2表达水平影响红细胞发育，揭示了GATA1调控胆固醇稳态介导红细胞发育的新分子机制，为红细胞发育相关疾病的诊治提供了新线索，也为发展体外造血提供了重要理论依据。上述研究得到了国家自然科学基金面上项目、山东省泰山学者、山东大学齐鲁青年学者和青年交叉创新团队项目资助。 山东大学赵保兵教授团队主要从事血液系统发育的分子机制和血液疾病的致病机理研究，包括红系细胞发育、造血干细胞自我更新及相关血液疾病的分子调控机制，发掘潜在药物靶标，并开展靶向小分子先导化合物筛选研究。迄今在J Clin Invest、Dev Cell、Blood、Leukemia和Haematologica等期刊发表SCI论文30余篇。 原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/epdf/10.1002/advs.202102669

关键词：红细胞,胆固醇,发育,调控,分子,细胞,机制,导致,水平,贫血

导读： 10月5日，中国科学院生物物理研究所研究员卜鹏程课题组与解放军总医院第五医学中心教授胡亮钉团队合作，在Advanced Science上发表了题为Cytoplasmic NEAT1 Suppresses AML Stem Cell Self-Renewal and Leukemogenesis through Inactivation of Wnt Signaling的论文。该研究首次发现实体瘤中被认为是促癌基因的长链非编码RNA NEAT1（Nuclear Enriched Abundant Transcript1）通过抑制急性髓系白血病（Acute Myeloid Leukemia， AML）自我更新，抑制AML的发生和发展。研究发现，定位于旁斑中的NEAT1从细胞核穿梭到细胞质中，与Wnt通路接头蛋白DVL2和E3泛素化连接酶Trim56结合，促进DVL2降解，抑制Wnt信号通路，进而抑制AML干细胞的自我更新。AML是髓系前体细胞中系列染色体易位和基因突变导致的，AML患者间存在极强的异质性，临床上针对不同的AML发病机理采取不同的治疗方法，仍有许多AML亚型尚无有效的靶向药物，且已有的靶向药物对发病机理复杂的患者疗效不显著，探究AML调控新机制，探索靶向不同类型AML的普适靶点是AML研究中亟待解决的问题。LncRNA NEAT1是细胞核中亚细胞结构旁斑的重要组成元件，具有NEAT1_1（3.7Kb）和NEAT1_2（23Kb）两种亚型，关于NEAT1_2的研究较多，作为旁斑的骨架，在旁斑的构建和mRNA的出核中发挥重要作用，在肝细胞肝癌、胃癌、结直肠癌和神经胶质瘤等实体瘤中均被认为是促进肿瘤细胞增殖、转移和耐药的促癌基因。然而，卜鹏程课题组发现，NEAT1在AML骨髓细胞中的表达显著低于正常骨髓细胞，且NEAT1能有效抑制FLT-ITD3、MLL-AF9和HOXA9/Meisl三种AML亚型的发展。进一步研究发现，细胞质中的NEAT1_1通过调控Wnt信号通路，抑制AML干细胞的自我更新、促进细胞分化。研究分析TCGA和GEO数据库发现，NEAT1在AML细胞中的表达显著低于正常血液细胞，且与AML患者的复发期呈正相关，即NEAT1表达越低的患者复发期越短。为了剖析NEAT1不同亚型在AML中的表达情况，科研究人员根据NEAT1_1和NEAT1_2的序列特征，即二者具有相同的5'端和不同的3'端序列，设计并合成了分别靶向总NEAT1和只靶向NEAT1_2的检测探针，并与胡亮钉团队合作收集了大量的健康人群、初治和复发AML患者的骨髓样本，检测证实了NEAT1_1和NEAT1_2均在健康、初治和复发AML患者的骨髓细胞中的表达依次降低，且在AML干细胞中的表达明显低于非干细胞。研究在RNA FISH染色中发现与NEAT1_2限制性定位于细胞核不同，部分NEAT1定位于细胞质中，且在非干细胞中的表达显著高于干细胞，推测这部分定位于细胞质中的是NEAT1_1。进一步核质分离检测证明NEAT1_1在AML细胞中发生细胞核到细胞质的转移，且在分化的AML细胞质中累积增多。体外AML细胞中敲低NEAT1_1促进细胞成克隆和增殖，抑制细胞分化和凋亡。研究分别利用两例初治和复发患者的AML细胞构建了PDX模型，发现无论是初治还是复发患者来源的AML细胞，敲低NEAT1_1均能促进AML细胞在骨髓、脾脏和外周血中的浸润，显著缩短小鼠的存活时间。研究人员还分别构建了FLT-ITD3、MLL-AF9和HOXA9/Meisl三种亚型的AML小鼠，发现NEAT1_1通过抑制骨髓中AML细胞自我更新和增殖，抑制AML细胞向外周组织浸润，进而抑制AML的发展。进一步研究发现，AML干细胞分化过程中，转录因子C/EBPβ表达上调和核定位蛋白NAP1L1的表达下调是调控NEAT1_1出核的关键。机制研究表明，细胞质中的NEAT1_1与Wnt信号通路的接头蛋白DVL2和E3泛素化连接酶Trim56结合，降解DVL2，抑制Wnt信号通路的激活。该研究发现了实体瘤中的促癌基因NEAT1在AML中具有抑癌功能，揭示了NEAT1_1出核新机制，为AML靶向治疗提供理论依据。研究工作得到科技部、国家自然科学基金委和中科院的支持。论文链接 NEAT1在实体瘤和AML中通过不同的作用机制，分别发挥促癌和抑癌功能

关键词：AML,NEAT1,细胞,抑制,表达,患者,干细胞,细胞质,复发,靶向

导读： 脊椎动物的B淋巴细胞和T淋巴细胞在发育过程中会通过V(D)J重排产生多样化的细胞表面受体来识别外来抗原，参与机体的适应性免疫过程。这些在基因组上串联分布的V、D、J片段两端带有重组信号序列（Recombination signal sequences , RSSs），可以被淋巴细胞中特异表达的重排酶RAG复合物识别并切割产生DNA双链断裂（Double strand break, DSB），在细胞的非同源末端链接（Non-homologous end joining，NHEJ）修复通路下，不同的V、D、J片段被连接起来从而产生多样化的细胞表面受体1。重排酶RAG是由重组激活基因（Recombination activating genes，RAGs）编码的RAG1和RAG2两个蛋白质组成，它们以复合物的形式靶向基因组中的RSS序列从而发挥V(D)J重排功能。其中，RAG1含有核酸酶活性，是催化活性中心；而RAG2无明确的蛋白质功能域，但可以将RAG1的活性提高数百到数千倍2-3。由于RAG复合物会在基因组中产生DSB，因此细胞将通过一定方式控制RAG复合物的功能活性以保证细胞中的基因组稳定性。已有的研究表明，RAG2的表达受到细胞周期的调控，其只在G1期表达而在进入S期后就快速降解，因此淋巴细胞中只有在G1时期才会发生VDJ重排过程4-5。而RAG2如何调控RAG1，以及细胞为何选择降解RAG2而不是RAG1和RAG2，都是待解决的问题。2021年10月12日，北京大学生命科学学院和北大-清华生命科学联合中心胡家志研究员课题组在Cell Reports发表了题为“RAG2 abolishes RAG1 aggregation to facilitate V(D)J recombination”的研究论文，系统性地阐述了在细胞周期中RAG2是如何调控RAG1的凝聚从而调控RAG1在细胞内的重排酶活性的，并且从进化的角度阐述了脊椎动物中RAG1和RAG2共进化的生物学意义。该研究通过表达以及内源荧光标记方式在多种细胞系中利用共聚焦成像技术观察并证明了人RAG1蛋白而不是RAG2在细胞核内形成凝聚体的现象（图1a-b）；进一步的研究发现，RAG2的存在可以破坏RAG1的凝聚状态（图1c）。研究人员接着利用实验室2019年开发的PEM-seq高通量测序方法，在整合了RSS序列的293T细胞中检测了凝聚状态和游离状态的RAG1活性。测序结果显示，凝聚态的RAG1几乎不能介导V(D)J重排，相反游离态的RAG1的重排酶活性增加了1154倍（图1d）。当利用RNA结合蛋白FUS迫使RAG1一直以凝聚体形式存在时，其重排酶活性也会被抑制。这表明细胞内RAG1的重排酶活性是受到自身凝聚体状态的调控的，这也能很好地阐述发育中的淋巴细胞在G1周期之外如何保护自身基因组的完整性。为了进一步研究RAG1凝聚体形成机制，研究人员进行了一系类氨基酸功能位点的突变（图1a），发现RAG1蛋白的催化活性中核心氨基酸DDE和位于蛋白质N端核定位信号对其产生凝聚作用发挥了重要的作用。此外，该研究还发现RAG2是通过与RAG1直接的相互作用来破坏RAG1自身的凝聚状态，而不依赖RAG2的PHD功能域（图1c）。图1. RAG2调控RAG1在细胞核内的凝聚状态研究人员还从进化角度探究了不同脊椎动物的RAG2蛋白对于人源RAG1凝聚体调控的普适性。结果发现只有人源的RAG2能够最大程度地破坏RAG1的凝聚状态从而起始VDJ重排活性，来自小鼠的RAG2只能恢复很弱的功能，而来自斑马鱼的RAG2则不能调控人源RAG1的凝聚状态（图2），表明了RAG2的起源可能跟RAG1一样早，两者共同进化，因此在物种之间表现出了一些不同的性质。图2.不同物种RAG2对人RAG1凝聚状态的调控综上所述，该研究发现了人淋巴细胞中RAG1的凝聚体现象以及RAG2参与RAG复合物活性调控的作用机制，论文最后使用“越狱”模型来对该作用机制进行更形象的描述，即在S/G2/M时期，细胞内的RAG1依赖于自身的结构特征或是在细胞核内无膜细胞器（如核仁）等的帮助下，在细胞核内以凝聚体的形式存在。该凝聚体像“监狱”一样，将重排酶RAG1与基因组上的RSS底物隔绝开来，而当细胞进入G1期，细胞内游离存在的RAG2通过直接结合到RAG1的表面，将RAG1从凝聚体“监狱”中释放出来，形成游离态的RAG复合体从而起始淋巴细胞内的V(D)J重排事件，维持了淋巴细胞的正常生理过程。图3.淋巴细胞内重排酶RAG1活性调控的“越狱”模型胡家志为该论文的通讯作者。博士研究生甘婷婷为论文的第一作者。博士研究生王渝鸿，博士后刘阳在该工作中亦有重要贡献。该论文还得到了耶鲁大学医学院David Schatz院士的支持和帮助。该工作得到了北大-清华生命科学联合中心、科技部国家重点研发计划、国家自然科学基金、细胞增殖与分化教育部重点实验室以及生命科学学院仪器中心（成像平台及流式平台）的大力支持。参考文献：1.Alt, F.W., Zhang, Y., Meng, F.L., Guo, C., and Schwer, B. (2013). Mechanisms of programmed DNA lesions and genomic instability in the immune system. Cell 152, 417–429.2.Oettinger, M.A., Schatz, D.G., Gorka, C., and Baltimore, D. (1990). RAG-1 and RAG-2, adjacent genes that synergistically activate V(D)J recombination. Science 248, 1517—1523.3.Schatz, D.G., Oettinger, M.A., and Baltimore, D. (1989). The V(D)J recombination activating gene, RAG-1. Cell 59, 1035–1048.4.Lin, W.C., and Desiderio, S. (1993). Regulation of V(D)J recombination activator protein RAG-2 by phosphorylation. Science 260, 953–959.5.Lin, W.C., and Desiderio, S. (1994). Cell cycle regulation of V(D)J recombination-activating protein RAG-2. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91, 2733–2737.

关键词：RAG1,RAG2,凝聚,重排,细胞,活性,调控,RAG,状态,淋巴细胞

导读： 脊椎动物的B淋巴细胞和T淋巴细胞在发育过程中会通过V(D)J重排产生多样化的细胞表面受体来识别外来抗原，参与机体的适应性免疫过程。这些在基因组上串联分布的V、D、J片段两端带有重组信号序列（Recombination signal sequences , RSSs），可以被淋巴细胞中特异表达的重排酶RAG复合物识别并切割产生DNA双链断裂（Double strand break, DSB），在细胞的非同源末端链接（Non-homologous end joining, NHEJ）修复通路下，不同的V、D、J片段被连接起来从而产生多样化的细胞表面受体1。重排酶RAG是由重组激活基因（Recombination activating genes, RAGs）编码的RAG1和RAG2两个蛋白质组成，它们以复合物的形式靶向基因组中的RSS序列从而发挥V(D)J重排功能。其中，RAG1含有核酸酶活性，是催化活性中心；而RAG2无明确的蛋白质功能域，但可以将RAG1的活性提高数百到数千倍2-3。由于RAG复合物会在基因组中产生DSB，因此细胞将通过一定方式控制RAG复合物的功能活性以保证细胞中的基因组稳定性。已有的研究表明，RAG2的表达受到细胞周期的调控，其只在G1期表达而在进入S期后就快速降解，因此淋巴细胞中只有在G1时期才会发生VDJ重排过程4-5。而RAG2如何调控RAG1，以及细胞为何选择降解RAG2而不是RAG1和RAG2，都是待解决的问题。,2021年10月12日，北京大学生命科学学院和北大-清华生命科学联合中心胡家志课题组在Cell Reports发表了题为RAG2 abolishes RAG1 aggregation to facilitate V(D)J recombination的研究论文，系统性的阐述了在细胞周期中RAG2是如何调控RAG1的凝聚从而调控RAG1在细胞内的重排酶活性的，并且从进化的角度阐述了脊椎动物中RAG1和RAG2共进化的生物学意义。,该研究首先通过过表达以及内源荧光标记方式在多种细胞系中利用共聚焦成像技术观察并证明了人RAG1蛋白而不是RAG2在细胞核内形成凝聚体的现象（图1a-b）；进一步的研究发现，RAG2的存在可以破坏RAG1的凝聚状态（图1c）。接着利用实验室2019年开发的PEM-seq高通量测序方法，在整合了RSS序列的293T细胞中检测了凝聚状态和游离状态的RAG1活性。测序结果显示，凝聚态的RAG1几乎不能介导V(D)J重排，相反游离态的RAG1的重排酶活性增加了1154倍（图1d）。当利用RNA结合蛋白FUS迫使RAG1一直以凝聚体形式存在时，其重排酶活性也会被抑制。这表明细胞内RAG1的重排酶活性是受到自身凝聚体状态的调控的，这也能很好的阐述发育中的淋巴细胞在G1周期之外如何保护自身基因组的完整性。为了进一步研究RAG1凝聚体形成机制，研究人员进行了一系类氨基酸功能位点的突变（图1a），发现RAG1蛋白的催化活性中核心氨基酸DDE和位于蛋白质N端核定位信号对其产生凝聚作用发挥了重要的作用。此外，该研究还发现RAG2是通过与RAG1直接的相互作用来破坏RAG1自身的凝聚状态，而不依赖RAG2的PHD功能域（图1c）。,,图1. RAG2调控RAG1在细胞核内的凝聚状态,最后，研究人员还从进化角度探究了不同脊椎动物的RAG2蛋白对于人源RAG1凝聚体调控的普适性。结果发现只有人源的RAG2能够最大程度的破坏RAG1的凝聚状态从而起始VDJ重排活性，来自小鼠的RAG2只能恢复很弱的功能，而来自斑马鱼的RAG2则不能调控人源RAG1的凝聚状态（图2），表明了RAG2的起源可能跟RAG1一样早，两者共同进化，因此在物种之间表现出了一些不同的性质。,,图2.不同物种RAG2对人RAG1凝聚状态的调控,综上所述，该研究发现了人淋巴细胞中RAG1的凝聚体现象以及RAG2参与RAG复合物活性调控的作用机制，论文最后使用“越狱”模型来对该作用机制进行更形象的描述，即在S/G2/M时期，细胞内的RAG1依赖于自身的结构特征或是在细胞核内无膜细胞器（如核仁）等的帮助下，在细胞核内以凝聚体的形式存在。该凝聚体像“监狱”一样，将重排酶RAG1与基因组上的RSS底物隔绝开来，而当细胞进入G1期，细胞内游离存在的RAG2通过直接结合到RAG1的表面，将RAG1从凝聚体“监狱”中释放出来，形成游离态的RAG复合体从而起始淋巴细胞内的V(D)J重排事件，维持了淋巴细胞的正常生理过程。,,图3. 淋巴细胞内重排酶RAG1活性调控的“越狱”模型,北京大学胡家志研究员为该论文的通讯作者。博士研究生甘婷婷为论文的第一作者。博士研究生王渝鸿，博士后刘阳在该工作中亦有重要贡献。该论文还得到了耶鲁大学医学院David Schatz院士的支持和帮助。该工作得到了北大-清华生命联合中心、科技部国家重点研发计划、国家自然科学基金、细胞增殖与分化教育部重点实验室以及生命科学学院仪器中心（成像平台及流式平台）的大力支持。,文章链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2211124721012882,参考文献：,1. Alt, F.W., Zhang, Y., Meng, F.L., Guo, C., and Schwer, B. (2013). Mechanisms of programmed DNA lesions and genomic instability in the immune system. Cell 152, 417–429.,2. Oettinger, M.A., Schatz, D.G., Gorka, C., and Baltimore, D. (1990). RAG-1 and RAG-2, adjacent genes that synergistically activate V(D)J recombination. Science 248, 1517—1523.,3. Schatz, D.G., Oettinger, M.A., and Baltimore, D. (1989). The V(D)J recombination activating gene, RAG-1. Cell 59, 1035–1048.,4. Lin, W.C., and Desiderio, S. (1993). Regulation of V(D)J recombination activator protein RAG-2 by phosphorylation. Science 260, 953–959.,5. Lin, W.C., and Desiderio, S. (1994). Cell cycle regulation of V(D)J recombination-activating protein RAG-2. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91, 2733–2737.

关键词：RAG1,RAG2,凝聚,重排,细胞,RAG,调控,活性,状态,淋巴细胞

导读： 2021年10月9日，生科院蒋争凡实验室和西北农林科大沈锡辉实验室与军事医学院周冬生实验室合作在国际著名学术期刊《PNAS》上以Research Article形式在线发表了他们在抗细菌天然免疫研究领域的最新成果----T6SS translocates a micropeptide to suppress STING-mediated innate immunity by sequestering manganese。,天然免疫通过模式识别受体感知病原体入侵，激活下游反应抵抗病原体感染。STING（MITA/ERIS）是细胞质内环化二核苷酸（CDN，包括细菌特有的c-di-GMP, c-di-AMP及多种连接方式的cGAMPs）受体。CDN与STING在细胞质一侧结合并导致STING转位至高尔基体；而高尔基体内合成的硫酸化糖胺聚糖（sGAGs）与STING高尔基体内一侧的氨基酸结合并引发STING多聚化，招募激酶TBK1，最终诱导I-型干扰素等细胞因子产生。自1987年在木醋杆菌（A. xylinum）发现c-di-GMP，2008年在枯草芽孢杆菌（B. subtilis）发现c-di-AMP及2012年在霍乱弧菌（V. cholerae）发现3’3’-cGAMP以来，已知绝大多数细菌都产生这些对其增殖、分化及侵染至关重要的第二信使。作为重要的防御手段，宿主细胞则产生了能够特异性识别这些对细菌不可或缺产物的受体（此处为STING蛋白），并激活宿主的抗细菌天然免疫反应。,细菌六型分泌系统（T6SS, type VI secretion system）是当前微生物领域的研究热点之一，可将多种效应蛋白投递至胞外环境、其它细菌或者宿主细胞内，在细菌抗胁迫、菌间竞争及与宿主的相互作用中发挥重要作用。2017年，沈锡辉实验室发现泰国伯克霍尔德氏菌（B. thailandensis）T6SS通过分泌一个锰离子结合效应蛋白TseM介导锰离子的运输，促进细菌的抗氧化胁迫能力和致病性。2018年蒋争凡实验室则揭示病毒感染导致宿主细胞内不同细胞器释放锰离子强烈促进cGAS-STING通路激活抵抗病毒感染。这些发现促使他们进一步探究这类具有锰离子结合功能的T6SS效应蛋白能否通过影响宿主胞内的锰离子水平来调节宿主天然免疫。,本研究发现革兰氏阴性菌假结核耶尔森氏菌（Y. pseudotuberculosis，Yptb）T6SS可分泌一个仅由48个氨基酸组成的锰离子结合蛋白TssS（T6SS-secreted micropeptide suppressing STING）促进细菌对锰离子的摄取。该基因缺失的突变体菌株（ΔtssS）对小鼠致病性显著下降，感染ΔtssS菌株小鼠的不同组织器官内细菌载量也明显下降。转录组学分析发现，与感染野生型菌株相比，感染ΔtssS菌株细胞内的I-型干扰素（Type I-IFNs）及干扰素刺激基因（IFN-stimulated genes, ISGs）表达明显上升，提示TssS能够抑制宿主抗细菌天然免疫反应；而将TssS中锰离子结合位点突变后，其对天然免疫系统的抑制能力和对小鼠的致病性显著下降，说明TssS的锰离子结合能力对其抑制天然免疫至关重要。进一步研究发现 LPS（革兰氏阴性菌细胞壁组分）处理能显著升高细胞质锰离子浓度，但在细胞中过表达TssS蛋白则能够抑制cGAMP/c-di-GMP所诱导的STING活化和下游基因表达。假结核耶尔森氏菌（Yptb）及同属的鼠疫杆菌（Y. pestis）和小肠结肠炎耶尔森菌（Y. enterocolitica）都产生对其存活、侵染非常重要的c-di-GMP。以往的研究表明锰离子可显著促进c-di-GMP与STING的结合。与此相一致，野生型Yptb或ΔtssS突变体感染野生型小鼠后，Yptb野生型感染的小鼠中细菌载量显著高于ΔtssS感染小鼠；而当这两种菌株分别感染STING缺失小鼠时，不同感染组之间细菌载量的巨大差异显著缩小。这些结果表明：一方面细菌产物LPS和c-di-GMP分别诱导宿主细胞内锰离子释放并共同促进STING活化；另一方面细菌产生并分泌TssS通过螯合胞内锰离子以削弱c-di-GMP对STING的结合及激活能力，实现对宿主抗细菌天然免疫反应的抑制。,,TssS螯合锰离子抑制宿主细胞内STING介导的抗细菌天然免疫反应,与其它已知细菌效应蛋白通常通过与宿主胞内蛋白、核酸等大分子相互作用以致病的方式不同，本研究揭示了一个细菌效应蛋白通过螯合宿主细胞内锰离子，从而抑制宿主天然免疫反应的新机制（如图所示）。作为一种新的细菌免疫逃逸机制，该研究为理解T6SS在细菌致病机制中的作用提供了新的视角，不仅对于深入理解病原微生物调节宿主免疫反应的分子机制有重要意义，也将为治疗一些自身免疫系统过度激活引起的疾病提供新的思路。更重要的是，在大量不同种属细菌的T6SS基因簇中都鉴定到类似功能未知的Mn2+结合蛋白，暗示本研究发现的天然免疫逃逸机制是一个细菌中普遍存在的、古老的抗宿主反应机制。,西北农林科大博士后朱玲芳、徐磊和北大生科院博士后王晨光为本论文共同第一作者，沈锡辉、蒋争凡和周冬生为共同通讯作者。本研究得到了“北大-清华生命科学联合中心”、北京大学“细胞增殖与分化”教育部重点实验室、国家重点研发计划、国家自然科学基金、中国博士后科学基金及西北农林科技大学双一流学科群建设计划等项目的资助。,原文链接：https://doi.org/10.1073/pnas.2103526118

关键词：细菌,宿主,STING,离子,天然免疫,蛋白,di,细胞,感染,小鼠

导读： 近日，中国科学技术大学冯雪竹研究员和光寿红教授课题组在Nucleic Acids Research期刊上发表了题为“Antisense ribosomal siRNAs inhibit RNA polymerase I-directed transcription in C. elegans”的文章。该研究以模式生物秀丽隐杆线虫为模型，发现了核仁RNA干扰现象：即反义核糖体小干扰RNA(risiRNA)可以诱导NRDE复合物进入细胞核仁中，并结合核糖体RNA前体；通过抑制RNA聚合酶I的转录活性，进而调控核糖体RNA的合成水平，抑制错误核糖体RNA代谢的积累。　　siRNA是一类长度约为22个核苷酸长的非编码小RNA，广泛存在动植物中，在机体的生长发育、生殖遗传和免疫防御等方面行使重要功能，也是优秀的药物分子。光寿红课题组多年来以秀丽隐杆线虫为研究对象，通过正向和反向遗传学筛选，鉴定了一系列抑制内源siRNA产生的SUSI因子，该类因子广泛参与了细胞中核糖体RNA加工和降解的过程。当SUSI因子功能缺陷时，细胞内会积累错误加工的核糖体RNA片段，这些片段与RNA依赖的RNA聚合酶相互作用后，会进一步诱导risiRNA的生成。risiRNAs与核糖体RNA序列互补配对，通过激活细胞核RNA干扰通路，进而调控核糖体RNA水平。　　在本研究中，课题组通过遗传学筛选克隆了一个抑制risiRNA产生的基因susi-5，该基因编码RNA外切酶体(exosome)的一个保守的催化亚基DIS-3。通过CRISPR基因编辑技术，课题组确认了RNA外切酶体任何亚基的功能缺陷都能引起risiRNA的积累。risiRNA诱导细胞核RNA干扰关键因子NRDE-2和NRDE-3进入核仁中，结合核糖体RNA前体，进而抑制RNA聚合酶I的转录活性。研究中还发现RNA外切酶体通过亚细胞定位的变化可以响应细胞核内核糖体RNA的稳态。RNA外切酶体在多种RNA的加工代谢过程中行使重要功能，主要定位于细胞核仁中。细胞内核糖体RNA稳态失衡会导致RNA外切酶体从核仁中移位于核质中。RNA外切酶体的正确亚细胞定位对于抑制risiRNA产生具有重要作用。　　本文的第一作者为博士研究生廖仕秒、陈向阳副研究员和博士研究生徐婷。冯雪竹研究员，光寿红教授以及朱成明副研究员为本文的共同通讯作者。该研究得到了国家创新人才项目、科技部、基金委、中科院和中国科学技术大学的大力支持。　　文章链接：https://academic.oup.com/nar/advance-article/doi/10.1093/nar/gkab662/6345473

关键词：RNA,核糖体,细胞,抑制,risiRNA,外切,核仁,干扰,课题组,因子

导读： 细胞内广泛存在相分离（Phase Separation）现象，成千上万的蛋白或核酸分子在复杂的细胞内部形成一个一个无膜“隔间”，就像油滴在水中一样，彼此互不干扰地参与细胞内如转录调控、应激、蛋白质质量控制、DNA复制等多种重要的生物学过程。1,6-己二醇（1,6-HD）是一种能够使得相分离液滴溶解的化学小分子，它是目前唯一的能同时破坏多种相的工具，所以非常有潜力应用于研究全局层面上相分离现象与其他生物学进程或结构之间的关系。但是，在不同的研究中，1,6-HD的应用条件千差万别，没有统一的标准，某些条件甚至会导致细胞凋亡、蛋白异常凝集、细胞皱缩、染色质“冻结”等副作用，这大大阻碍了这一工具的应用。另一方面，真核细胞的染色质会以特定的形式折叠在细胞核内，在空间上形成有序的三维结构，这些三维结构对细胞生命活动至关重要，与细胞命运决定和疾病发生都有关系。那么染色质三维结构是如何被有序组织起来的呢？一直有假说认为相分离在其中发挥了功能，但目前只有间接的或点例的证据，缺乏全局水平上研究。近日，我院丁俊军课题组在Genome Biology 发表了题为Time-dependent effect of 1,6-hexanediol on biomolecular condensates and 3D chromatin organization的文章，首次系统测试并报道了一个适用于多种细胞系、副作用较小的1,6-HD应用条件（1.5%, 2 min），并绘制了1,6-HD处理下动态的染色质三维结构图谱，用于探究相分离和染色质三维结构的关系。在该项工作中，研究人员首先在小鼠胚胎干细胞（mESCs）中测试了不同浓度和时间的1,6-HD处理对多种相分离液滴、细胞活力、细胞核体积和染色质动态性的影响。文章发现，1.5%的1,6-HD对相分离液滴具有时间依赖效应，短时间处理使得相分离液滴溶解，而长时间处理则使得其重建（图1），另外更高浓度（5%和10%）的1,6-HD在短时间处理（2 min）时已经会导致严重的细胞凋亡。因此，该研究首次系统测试了1,6-HD的条件并报道了低浓度、短时间（1.5%, 2 min）是优化的1,6-HD应用条件，这一条件在多种细胞系中都能在不导致细胞凋亡、不影响细胞核体积和染色质动态性的情况下破坏相分离，可以应用于研究相分离与其他生物学进程之间的关系。1,6-HD对相分离液滴的时间依赖效应研究人员进而绘制了低浓度1,6-HD处理下时间动态的染色质三维结构图谱，首次描述了相分离溶解和重建过程中染色质结构的变化。研究结果表明，短时间1,6-HD处理会导致长距离互作减弱、短距离互作增加、基因组区室化增强、激活的基因组区室（Compartment A）内部互作更加均匀、抑制的基因组区室（Compartment B）向Compartment A转变、拓扑相关结构域（TAD）重组，而长时间的1,6-HD处理则具有相反的影响，这些结果说明1,6-HD对不同层级的染色质三维结构的影响也具有时间依赖效应，这将相分离与染色质三维结构联系起来。除了分析1,6-HD对整体的染色质结构的影响，该研究还结合ChIP-seq数据鉴定了相分离组分富集的染色质相互作用。文章发现这些相互作用都是较长距离的，而且在1,6-HD处理之后剧烈减弱了。这些结果支持了一个新的模型，即相分离是通过维持长距离的染色质相互作用来维持不同层级的染色质三维结构的。该项研究提供了一个优化的1,6-HD应用条件，有助于未来相分离的功能研究。基于这个条件，研究探讨了相分离与染色质三维结构的关系。该项研究优化了有力的研究工具，丰富了我们对染色质结构的认识，也为未来进一步研究特定的相分离液滴对染色质结构的具体影响提供了资源。丁俊军课题组的博士研究生刘心仪和姜少帅博士为本文共同第一作者。丁俊军教授为这篇文章的唯一通讯作者。原文链接：https://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13059-021-02455-3 （稿件来源：丁俊军教授团队，初审：张晓红，审核：周家国，审核发布：张琪）

关键词：染色质,分离,HD,结构,细胞,条件,影响,液滴,关系,时间

导读： 近日，我室杭纬教授课题组在单细胞质谱成像研究方面取得进展，相关成果以“Single-Cell Mass Spectrometry Imaging of Multiple Drugs and Nanomaterials at Organelle Level”为题发表于ACS Nano（DOI: 10.1021/acsnano.1c02922）。 探究化学物质在生物组织甚至单细胞内的位置分布是生命科学研究的重要方向之一。特别是随着金属元素组学和元素标记技术的发展，对于元素的分析检测显得愈加重要。电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）技术是最常用的元素检测手段之一，通过与激光剥蚀（LA）采样方法的联用，使得这种传统的溶液进样质谱技术具有了原位分析和化学成像的能力。但是，由于衍射极限以及透镜数值孔径等因素的限制，这种激光采样方法的空间分辨能力仍然停留在微米级别，难以应用于单/亚细胞水平上的成像研究。 杭纬教授课题组首次设计了具有三通结构的样品剥蚀池，从而将微透镜光纤激光采样技术与ICP-MS相结合，搭建了LA-ICP-MS成像平台，该装置可以实现低至400纳米空间分辨率的质谱成像，对生物组织和单细胞内的多种化学物质进行可视化探测，还易于实现可调分辨率的成像模式。以同一片小鼠小肠剖面组织为研究对象，获得了从500纳米至10微米空间分辨率的药物分布成像图片。利用高分辨模式的成像，能够更直观、精准地描绘出小肠组织内微小的细节和药物的分布，从而揭示小肠对药物的吸收和作用机理。这种高空间分辨率的LA-ICP-MS成像装置也可以在细胞器水平上实现对单细胞的成像分析。课题组将HeLa细胞与金纳米棒、卡铂等药物同时培养，而后将在石英片上贴壁生长的细胞放入样品剥蚀池内进行成像检测。结果表明金纳米棒主要位于细胞的溶酶体内，而金纳米棒上修饰的不同基团会影响细胞对纳米材料的摄取量、细胞的形貌以及活性产生；而卡铂药物被癌细胞摄取后主要分布在细胞核内，通过与核内DNA的相互作用诱导癌细胞凋亡。这种纳米级空间分辨的元素成像有望在生物学与医学等多领域获得应用，在纳米尺度下揭示待测物的化学物质分布。 该工作是在杭纬教授指导下完成的，实验部分主要由2017级博士研究生孟一凡（已毕业）完成，高超鸿、陆桥等参与了论文的研究工作。研究工作得到国家自然科学基金（项目批准号：21974116、21521004、22027808）的资助和支持。 论文链接:https://doi.org/10.1021/acsnano.1c02922

关键词：成像,纳米,细胞,药物,分布,空间,ICP,单细胞,分辨率,质谱