Plant Cell| 最新综述!系统总结CRISPR技术创制植物突变体库的策略、方法和未来展望

CRISPR筛选技术 合成生物技术
eplants    2021-01-28    362

近日,The Plant Cell 在线发表了比利时VIB-UGent植物系统生物学中心的Thomas B Jacobs教授的题为 CRISPR Screens in Plants: Approaches, Guidelines, and Future Prospects 的特邀综述文章。
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CRISPR因组编辑技术大规模构建突变体库并进行功能筛选是高效便捷获得重要突变体和快速克隆对应基因的有效方法,同时能够为分子设计育种提供重要的供体材料。虽然该技术具有巨大的应用潜力,但在植物中的应用仍处于起步阶段。本文讨论了在植物中构建CRISPR筛选系统的原理、工具和构建流程;并讨论了在植物中如何设计CRISPR基因敲除筛选系统及多项设计方案。最后,作者讨论了CRISPR筛选系统对植物基因组中冗余基因功能研究的独特能力,多筛选系统的组合使用有可能产生高效的突变集合,并有助于基因调控网络的挖掘。未来,通过将这种方法与过去二十年产生的大量基因组图谱相结合,CRISPR 筛选技术的实施为分析植物基因组提供了更深层次分析的工具,并将导致功能生物学和合成生物学的巨大进步。
首先,作者介绍了CRISPR基因编辑技术的原理和针对作物育种需求所开发的应用工具。
图片.png                                                           图1:CRISPR-Cas 基因组编辑工具。

(A)Cas9-gRNA复合物,复合物包含行使剪切功能的 Cas9 蛋白以及特异靶向基因组的 gRNA 。通过 gRNA 序列与基因组序列的特异性匹配, Cas9 蛋白能在基因组特定位置行使剪切功能。在不完全的DNA修复之后,可以在目标位点产生核苷酸缺失或插入。(B)通过将Cas9(D10A)(NCas9)或Cas9(D10A H840A)(dCas9)融合到胞苷或腺嘌呤脱氨酶结构域来构建碱基编辑器。胞苷碱基编辑分子(CBE)优先引入C到T突变,而腺嘌呤碱基编辑分子(ABE)催化A到G突变。碱基编辑器在受限的编辑窗口中脱氨核苷酸(绿色核苷酸)。(C)CRISPR干扰(CRISPRi)或CRISPR激活(CRISPRa),dCas9与转录抑制因子或激活结构域融合,可以调节RNA水平。红色三角形:核酸酶切割位点。D10A和H840A是使核酸酶域失活的Cas9突变。
接着,作者通过对EMS-Tilling、T-DNA插入、人工RNAi、CRISPR等构建的突变体库的突变偏好性、随机突变或靶向突变、脱靶率、突变群体大小、候选基因分离的难易程度等特征进行了比较,指出使用CRISPR进行筛选的主要优点在于它易于识别因果基因,并且特异性相对较高(表1)。此外,允许多个基因同时为靶点,因此可以克服基因冗余;并使用小得多的群体就能进行饱和突变。最后,CRISPR 工具箱的多功能性使研究人员不仅能够产生功能突变的插入和丢失,而且还能产生一系列基因组扰动,例如特定的单核苷酸变体或转录变化,这是其他基因敲除技术所不能实现的。
                           表1:植物遗传筛选方法的比较分析

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进一步,作者分析了CRISPR筛选技术在植物中的应用实例。在动物细胞系统内,CRISPR筛选技术被广泛用于正向遗传学研究,而在植物中只报道了少数的几个研究,主要集中在水稻、玉米、番茄、大豆的研究中。比如,在水稻中,构建了CRISPR敲除突变体库,每个载体是只含有一个gRNA的T-DNA,利用88,541个gRNAs和2~3个171gRNAs的文库,对中花11水稻中基因组中的16934,234个非转座元件(TE)蛋白编码基因(约占全部基因的83%)进行编辑,产生了一个91,004个个体的T0突变群体,突变率约为80%(李家洋院士团队,2017年)。
                                        表2:CRISPR筛选技术在植物中的应用
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随后,在分析了CRISPR筛选技术的当前应用之后,借鉴这些实例的方法和经验,作者提出了进行CRISPR敲除筛选技术所需要的设计准则。分别从编辑工具的选择、筛选方法的选择、目标数量、群体大小、诱变效率、代表性因子(代表在同一基因中应该有突变的独立品系的数量,以在关联基因型和表型时提供可信度)、筛选的目标位点、GRNA的文库构建策略、数据获得和验证以揭示基因功能等几个方面进行了分析和讨论,并提供了一般性的参考建议。
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植物CRISPR基因敲除筛选的工作流程和设计参数
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利用CRISPR筛选技术开发植物gRNA预测工具
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利用CRISPR筛选对植物基因调控网络进行定位和验证

最后,作者对CRISPR系统在植物中的应用进行了展望。作者预计在不久的将来,进行CRISPR筛查或订购CRISPR 文库将变得与进行EMS筛查或T-DNA/转座子插入一样常见。并重点介绍了当前一些需要克服的限制。比如,1)对gRNA效率和编辑结果的预测工具开发。gRNA是建立CRISPR实验的关键步骤,对CRISPR文库的质量有很大影响。具有更多活性的gRNA提高了系统的效率,并减少了必要群体的大小。然而,随着gRNA数量的增加,这样的预筛选变得不那么实用。因此,希望有一条流水线来选择高活性的gRNA。预测在目标位点产生的突变类型是gRNA设计的另一个重要要素。2)记录单细胞水平的基因编辑结果;3)CRISPR技术的组合使用。比如,组合CRISPR遗传筛选技术可同时靶向特定家族、调节网络或感兴趣的代谢途径中的所有基因来实现多目的的要求。
综上所述,作者预计CRISPR遗传筛选技术的发展将极大地加快植物功能遗传学和合成生物学的步伐。

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