副猪嗜血杆菌的血清型较多,目前对HPS血清分型方面的研究尚不全面,根据同型细菌外膜蛋白抗原的不同,至少可分为15种血清型,另有20%以上的分离株不能分型。而且不同国家或地区HPS的流行血清型不同,如日本、德国、美国、加拿大和澳大利亚以血清型4、5 和13 最为常见,我国也多次报道了不同省市的分离株,如蔡旭旺等报道了全国10多个省市的HPS分离株,认为我国当前流行的血清型主要有4,5,12,13型,但不同地方的优势血清型有所不同,所以对副猪嗜血杆菌病的防控增加难度。目前猪场大多采用药物预防和疫苗免疫这两种方法进行防控,但随着药物的广泛使用,耐药性也日渐增强,需要不断更新轮换药物,所以使用疫苗防治副猪嗜血杆菌病是最有效的办法之一,因此制备与本地区血清型相一致的疫苗显得尤为重要。本研究对当前危害仔猪和保育猪最严重的猪副嗜血杆菌病临床临床疑似病例进行病原分离鉴定,通过血清分型鉴定,掌握了龙岩市主要流行的猪副嗜血杆菌血清型;对基因进行扩增、克隆和序列测定,并与标准毒株进行了同源性比较分析,在基因水平上对猪副嗜血杆菌进行了分型研究,并对分离的病原菌进行了毒力测定、致病性分析、耐药性和药物敏感性研究;初步掌握了猪副嗜血杆菌分离株的培养、生化特性、保存及驯化技术,优化了优势菌株大规模液体培养的工艺条件;对本研究分离的不同血清型菌株进行筛选,选出4,5型2个主要优势血清型的菌株作为疫苗株,用筛选的菌株进行人工培养,将培养菌液灭活后制成多价副猪嗜血杆菌灭活疫苗。构建了规模化猪场副猪嗜血杆菌病的防控技术体系,对副猪嗜血杆菌病的防控具有重大意义。具体体现在以下四个方面：1、副猪嗜血杆菌病原菌分离、血清型鉴定和分离株生物学特性研究2012年以来,分离158例临床疑似病例,从临床疑似病例中分离得到58株菌株,经卫星现象、生化鉴定等实验室诊断,确定为猪副嗜血杆菌的菌株28株,进一步应用血清学方法,对菌株进行了血清型鉴定。其中,血清4型5株,血清5型7株,血清1型1株,血清12型1株,血清13型2株,其它型6株,无法分型6株。初步掌握了闽西地区猪群中HP流行特点,为地区性免疫控制方案的探讨提供理论依据。2、副猪嗜血杆菌分离菌株的基因序列的测定与分析建立了快速准确鉴定副猪嗜血杆菌PCR方法,从分子水平对副猪嗜血杆菌进行了鉴定。针对副猪嗜血杆菌16SrRNA序列设计了一对特异性引物,并扩增出821bp的特异性片段,据此建立了快速准确鉴定副猪嗜血杆菌PCR方法,临床应用该方法检测28份疑似病例,26份为阳性,阳性率达92.9%。3、建立了一种大规模液体培养本地分离株HPS的方法通过副猪嗜血杆菌在不同液体培养基的生长情况、不同装液量发酵试验、在最适培养基中生长曲线试验、不同浓度的NAD对副猪嗜血杆菌发酵生长情况的影响研究,建立了一种大规模液体培养本地分离株HPS的方法,在菌体的数目达到最高峰收获菌体可以获得最大数量的有效疫苗抗原,菌体浓度可达108/ml。具体如下：（1）最适合副猪嗜血杆菌液体发酵的培养基是TSB培养基,即胰胨大豆肉汤培养基。（2）副猪嗜血杆菌液体发酵的最适装液量为100ml/250ml。（3）副猪嗜血杆菌在TSB培养基、最适合装液量中发酵生长,培养24h时OD600值达到最大, pH值最低,发酵过程中大量产酸。（4）副猪嗜血杆菌活菌数和OD600值的关系表现为当OD600值小于1时,呈良好的线性关系,当OD600 值越大,偏离的趋势越明显。（5）副猪嗜血杆菌生长依赖NAD提供的V因子,从生长情况和经济效益考虑,副猪嗜血杆菌液体发酵时选择NAD浓度为0.004%最适宜。4、副猪嗜血杆菌疫苗株筛选和多价灭活疫苗的研制对本研究分离的不同血清型菌株进行筛选,选出4、5型2个主要优势血清型的菌株作为疫苗株,用筛选的菌株进行人工培养,将培养菌液灭活后制成抗原含量为8×l09和7.2×l09 CFU/ml的副猪嗜血杆菌油乳剂多价灭活疫苗。对该灭活疫苗的物理性状、安全性进行研究,证实该疫苗物理性状稳定,安全性较好,仔猪免疫后均无任何异常临床表现及免疫副反应。应用该疫苗对龙岩市2个规模化猪场的保育猪进行疫苗保护试验,结果表明使用疫苗加强免疫后,副猪嗜血杆菌病的发病率显著下降,由未免疫时的70%下降至27.5％,降低了42.5％,死亡率由未免疫时的37.5%下降至10%,降低了27.5%,说明在闽西地区规模化猪场发生的副猪嗜血杆菌病主要是由4型、5型副猪嗜血杆菌引起的,应用地方分离株制备疫苗可以很好地防止该病的发生。
黄教授
