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内容有点难，但是思路很经典，是高分研究论文中常用的套路。而其中用到的Loss-of-Funtion常见的科研思维方式，跟细胞水平中Knock-down或knock-out的意思类似。感兴趣的果友可以看看其他高分研究论文，很多这种Figure。

芒果文献的第二篇文献，我们选取膜分子来进行分享。在芒果病毒漫谈系列中，我们专门介绍过一类膜分子——B细胞相关分子是，B7基因家族（漫谈病毒07.B细胞相关分子做生信，从B7基因家族说起）。董晨团队2018年在Immunity发表题为“Co-inhibitory Molecule B7 Superfamily Member 1 Expressed by Tumor-Infifiltrating Myeloid Cells Induces Dysfunction of Anti-tumor CD8+ T Cells”的论文，重点分享膜分子蛋白在肿瘤免疫研究中的思路和方法。

B7H4 (B7S1, B7x, VTCN1) 是B7家族成员之一，于2003年被鉴定，与人PD-L1和B7H3 具有18%和24%的氨基酸同一性。它由两个免疫球蛋白 (Ig) 样结构域，一个大的疏水跨膜结构域和两个胞内氨基酸组成。B7H4表达仅限于专职抗原呈递细胞 (APC)，其潜在受体在活化T细胞上表达。作者发现，①在肝癌肿瘤微环境中，大多数B7H4表达在CD45+细胞上，并且在癌旁和肿瘤组织中发现更高量的B7H4表达；②B7H4R在肝组织CD8+ T、CD4+ T和NKT细胞上的表达高于外周组织。接下来，作者探究B7H4表达的功能（Figure）。

接下来，作者确定B7H4缺乏或阻断是否影响肝癌肿瘤模型中的肿瘤进展。将呈对数生长的Hepa1-6皮下注射到野生型(WT)和B7H4敲除小鼠中，每天监测肿瘤生长。B7H4缺乏显著抑制Hepa1-6肿瘤的生长（图2A）。作者还使用抗B7H4阻断抗体测试该模型中B7H4阻断的治疗效果。从肿瘤接种后第5天开始，每隔一天将100μg对照抗体或抗B7H4抗体腹膜内注射到WT小鼠中。正如预期的那样，用抗B7H4抗体治疗小鼠的Hepa1-6肿瘤生长比用对照抗体治疗的小鼠慢（图2A）。因此，该结果表明B7H4可能通过抑制CD8+T细胞的功能来抑制HCC中的抗肿瘤免疫反应。

在实体瘤模型Hepa1-6中证明B7H4的肿瘤促进作用后，作者接下来试图探索B7H4在血液系统肿瘤中的作用并研究其潜在机制。正如预期的那样，B7H4阻断增加小鼠B细胞淋巴瘤（A20）小鼠模型的存活率（图2B）。此外，源自EL4小鼠T细胞淋巴瘤（E.G7）的小鼠模型中测试B7H4抑制的效果，缺乏B7H4或抗体阻断B7H4抑制E.G7的皮下肿瘤生长（图2）C）。此外，抗B7H4抗体处理的携带E.G7小鼠在其他部位移植肿瘤细胞再次攻击时，显示出比对照组更强的肿瘤生长抑制（图2D），表明抗B7H4阻断引起对肿瘤的记忆反应。

为更密切地研究B7H4及其受体抑制抗肿瘤免疫的免疫机制，作者重点研究肿瘤细胞表达鸡卵清蛋白（OVA）蛋白的E.G7模型，以研究肿瘤抗原特异性免疫反应。与Hepa1-6模型不同，在E.G7模型中抗原提呈细胞和肿瘤细胞上均观察到B7H4的高表达（图2E）。对E.G7肿瘤切片进行免疫荧光染色以检测肿瘤微环境中B7H4的表达。B7H4表达仅在CD45 +细胞（肿瘤细胞或宿主免疫细胞）上观察到，但不在CD45 -细胞上观察到。在流式细胞术分析中，作者进一步将CD11b +骨髓细胞细分为粒细胞(CD11b + Ly6G + )、单核细胞(Ly6C hi MHCII - )、Ly6C int MHCII -未成熟巨噬细胞、Ly6C + MHCII hi 未成熟巨噬细胞、Ly6C lo MHCII lo 肿瘤相关巨噬细胞、Ly6C lo MHCII hi 肿瘤相关巨噬细胞和Ly6C lo MHCII hi肿瘤相关树突状细胞。Ly6C + MHCII hi未成熟巨噬细胞，MHCII hi 肿瘤相关巨噬细胞，尤其是肿瘤相关树突状细胞显示B7H4的高表达，高于脾脏中的对照（图S2 F）。与Hepa1-6肿瘤一致，CD8+ T细胞是E.G7肿瘤中表达B7H4R的主要群体（图2F ），其表达的B7H4R量高于脾脏和淋巴结中的B7H4R 。然而，在外周，B7H4R在淋巴结中的NK和γδT细胞上高表达（图S2 H）。B7H4R + CD8 + T细胞在OVA特异性亚群中比总CD8 +肿瘤浸润性T细胞更富集（图2 G），表明B7H4R在遇到抗原时在肿瘤特异性CD8 + T细胞上上调。

为鉴定B7H4的靶细胞，作者去除携带E.G7的WT和B7H4 -/-小鼠中的CD8 + T、CD4 + T或NK细胞。仅当CD8 + T细胞耗尽时，B7H4 -/-小鼠的抗肿瘤作用才会消失（图2H）。由于B7H4在E.G7模型中的抗原提呈细胞和肿瘤细胞上均表达，作者评估B7H4在抗原提呈细胞或肿瘤上的表达是否在介导免疫抑制中起更重要的作用。因此，在E.G7的B7H4-/-小鼠模型中使用抗B7H4抗体阻断抗原提呈细胞上的B7H4，作者没有观察到抗B7H4抗体处理对B7H4 -/-小鼠肿瘤生长的进一步抑制（图2 I），这表明抗原提呈细胞上的B7H4是E.G7小鼠模型中B7H4介导免疫抑制的主要部分。

总之，CD8+ T细胞与抗原提呈细胞上B7H4的相互作用可能会抑制其抗肿瘤反应。