最近几年,大多数的研究都集中在体外生长的结核分枝杆菌外分泌蛋白上,而且一些蛋白已经被克隆并且评价了他们的血清学诊断价值。
吴雪琼等[20-22]分别对MPT63、MPT64、ESAT-6及KatG蛋白进行了血清学诊断的初步研究,结果显示四种抗原蛋白作为抗原检测抗结核抗体的阳性率只有12%-20% ,在各种结核分枝杆菌分泌性蛋白中是较低的。
所以,他们单独作为结核病血清学诊断试剂意义不大,可作为结核病血清学诊断和皮肤诊断的组合抗原的候选者之一。
Lyashchenko[21]等用ESAT-6、14kDa、MPT63、19kDa、MPT64、MPT51、MTC28、Ag85B、38kDa及KatG共10种抗原用ELISA法检测血清中抗结核抗体进行结核病血清学诊断的分析研究,结果显示近90%的患者血清中至少存在一种结核抗体,抗体在体内表达的数量、种类及水平可以随患者的免疫背景、疾病的不同阶段以及结核分枝杆菌菌株的不同而不同。
本课题组在前期研究中,已成功构建了结核分枝杆菌早期分泌蛋白ESAT-6、CFP10、Ag85B、MPT64和休眠相关抗原Hsp16.3原核表达载体,并分别诱导、表达、纯化了这5种蛋白,经Western-blot法鉴定了5种抗原的免疫原性[12,13, 23,24,25]。
通过对101例结核病住院患者进行痰菌检查、结明试验、PPD实验和MPT64蛋白抗体检测, 评价了MPT64蛋白在结核病血清学诊断中的价值。结果表明,对肺结核患者检出率,抗体与抗体检出率阳性一致率为75.6%;对胸膜炎患者和健康者研究表明, 抗体特异性高达86.7%, 明显高于PPD检测。
本课题组进一步对ESAT6-MPT64融合蛋白进行研究。结果显示,重组的ESAT-MPT64蛋白用于诊断结核病的敏感性为67.7%,高于单个MPT64蛋白。表明多个抗原联用,可提高血清学诊断的敏感性,同时,融合蛋白的特异性远远超过PPD。
因此,联用两种结核抗原用于血清学诊断试剂有助于提高其敏感性和特异性[12,13]。
对于结核病的临床诊断由于结核抗原多而复杂,所以结核病患者的抗体谱呈现多样性。
目前尚无任何一种用于ELISA的抗原检测的灵敏度达到100%,不同的病人需用不同的抗原检测抗体。
用几种不同的重组结核分枝杆菌分泌蛋白进行的研究表明,他们的免疫识别在不同的病人之间是随机变化的,结核病患者的抗体反应是针对结核抗原的,任何一种抗原都无法检测结核病患者血清中所有的结核抗体,这要求设计一个由许多种抗原组成的鸡尾酒式的关于结核病的血清学诊断试验。
具有灵敏度高和特异性强的关于结核病的血清学诊断试剂很可能要求由许多种再结合抗原或是多种抗原的混合体构成。
因此,筛选多个纯化特异性抗原组成的联合抗原来检测结核病患者体内抗体,增加血清学诊断的敏感性,是目前结核病血清学诊断研究中的主要方向。
根据国内外及本室研究结果,选择结核分枝杆菌早期分泌蛋白ESAT-6、CFP10、Ag85B、MPT64和休眠相关抗原Hsp16.3,确定各种蛋白的最佳抗原包被浓度和血清稀释度后,采用酶联免疫吸附试验( ELISA) 检测结核病人和健康者血清,通过受试者工作特征曲线法(Receiver Operating Characteristic,ROC) [29]建立结核抗原诊断效能评价体系,用Youden指数评价得出最适的抗原组合,初步建立以5种特异抗原为基础的结核血清学诊断评价体系。
本研究的完成将有助于建立针对诊断结核病患者不同病程阶段枝杆菌特异性抗原组合,并有望获得敏感性和特异性高的结核病血清学快速诊断方法。