技术领域

本发明属于分子遗传学领域，涉及绵羊单核苷酸多态性(SNP)分子标记的筛选 与检测，特别涉及利用 PCR-SSCP 方法快速检测 NELF 基因组第 454 位点单核苷酸 多态性。具体来说，就是对 PCR 扩增获得的产物变性之后进行聚丙烯酰胺凝胶电 泳，然后根据电泳结果确定其单核苷酸多态性。

背景技术

近 20 年来，尤其是近 10 年来，分子遗传学和分子生物技术有了突飞猛进的 发展，其中，分子遗传标记是目前在家畜育种中研究得最多的内容，也是近期内 最可能在家畜育种中得到广泛应用的研究项目。遗传标记是指那些可以准确鉴别 的、能反映个体特异性的遗传特征。分子遗传标记则是指以个体遗传物质即核苷 酸序列变异为基础的 DNA 分子标记，是 DNA 水平遗传多态性的直接反映。利用 分子标记辅助选择育种，是现代动物分子育种的一项主要研究内容，其直接在 DNA 水平上对性状的基因型进行选择，因此其选种的准确性大大提高，克服了传 统动物育种方法的缺陷。

单核苷酸多态性(SNP)是一种重要的分子遗传标记，它是由美国学者 Lander 于 1996 年提出的第三代 DNA 遗传标记，是基因组中单个核苷酸变异引起的 DNA 序列多态性，包括碱基的转换、插入及缺失等形式。PCR-SSCP 技术的基本原理是 PCR 扩增后的 DNA 片段经变性成单链 DNA，单链 DNA 在中性聚丙烯酰胺凝胶中 电泳时形成不同的立体构象，其构象直接影响泳动速率，相同长度的 DNA 单链 其核苷酸顺序仅有单个碱基的差别，就可以产生立体构象的不同，造成泳动速率 的不同，产生不同的泳动带。因此，可以通过 PCR-SSCP 技术检测基因组是否存 在 SNP 位点，并且准确的鉴别 SNP 位点的基因型。现在已经公认单链构象多态性 (SSCP)可作为遗传标记应用于育种中。该方法不仅具有 DNA 测序法的准确性，又 克服了费用昂贵、繁琐操作、假阳性的缺点，而且检测序列位点无特殊要求。

鼻胚胎促黄体激素释放激素因子(Nasal embryonic LHRH factor，NELF)编码基 因与动物的生殖有密切关系。Samuel D.Quaynor 等通过创建纯合 NELF 敲除(KO) 小鼠模型，证明雌性小鼠 NELF 基因敲除将推迟阴道口开放，并没有延迟第一次 发情的时间，减少了子宫重量并且减少了 GnRH 的神经元数目。与此相反，雄性 小鼠的青春期表现正常。NELF 敲除导致雌雄小鼠都表现为生育能力受损，平均窝 产仔数降低。此外，越来越多的报道表明，NELF 在小鼠的生殖方面有重要作用。 绵羊的 NELF 基因定位在第 20 号染色体上，全长 5928bp，编码区全长 1112bp。

目前，国内外对 NELF 基因多态性的研究主要集中于小鼠等模式动物，而对 于家畜 NELF 基因单核苷酸多态性的研究尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用 PCR-SSCP 快速检测绵羊 NELF 基因单核苷酸 多态性的方法及其应用，从而为绵羊的分子标记辅助选择育种提供基础资料，加 快中国绵羊的种质资源改良工作。